Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Р.аствор Хэнкса.
Катарактные ножи, ножи Сванн-Мортона № 11. Анатомические иглы.
Часовые пинцеты, прямые пинцеты 10 см.
Ножницы среднего размера.
Тонкие ножницы для операций.
3.3.2. Протокол
I. Покройте дно чашек Петри слоем хлопковой ваты или лучше тремя слоями фильтровальной бумаги с прорезанными в них одним или двумя отверстиями диаметром 3,5 см и простерилизуйте сухим жаром (см. гл. 1).
II. Утром в день получения эксплантатов пропитайте 10 мл стерильной дистиллированной воды или раствора Хэнкса слой ваты или фильтровальной бумаги, используя градуированную пипетку, и установите часовые стекла над отверстиями в подложке. Эти отверстия обеспечат прохождение света при работе с бинокулярной лупой и облегчат макроскопическое обследование эксплантата в ходе культивирования.
III. Для культивирования тканей птиц приготовьте сгусток, смешивая 10 капель куриной плазмы с 10 каплями куриного эмбрионального экстракта [6]. Быстро и тщательно перемешайте смесь стеклянной палочкой.
IV. Для культивирования тканей млекопитающих добавьте инактивированную сыворотку крысы, лошади или теленка к смеси куриного эмбрионального экстракта и плазмы кур, обычно в соотношении плазма : сыворотка : экстракт 2:1:1. Это соотношение может быть изменено в соответствии с типом используемой ткани и характером решаемой проблемы. В экспериментах, связанных с изучением влияния химических агентов на рост и дифферендировку, добавляйте исследуемое соединение к смеси до образования сгустка.
V. Используя тонкие ножницы и часовой пинцет, удалите орган или часть органа, промойте его раствором Хэнкса и перенесите на стеклянную пластинку. С помощью катаракт-ных ножей, анатомических игл или ножей Сванн-Мортона, обрежьте ткань так, чтобы размер кусочка не превышал 2x2x2 мм. По возможности поместите стеклянную пластинку на кусочек черной бумаги (так будет легче препарировать). Весьма существенно, чтобы в ходе работы ткань увлажнялась раствором Хэнкса.
VI. Перенесите от одного до трех эксплантатов на сгусток с помощью катарактного ножа или пипетки с широким кончиком. В последнем случае эксплантаты обрабатывают раствором Хэнкса, размещают на сгустке и избыток жидкости отсасывают с помощью капиллярной пипетки.
VII. Перенесите чашки Петри с одним или двумя часовыми стеклами в термостат на 37,5 °С. Не ставьте чашки Петри непосредственно на металлические полки, а подкладывай-те подставки из дерева. Это предотвратит конденсацию воды на внутренней стороне чашек Петри, которая может капать на эксплантаты и повреждать их.
3.3.3. Смена среды
Среду следует менять каждые 2—3 сут в случае тканей птнц, и каждые 3—4 сут в тканях млекопитающих. Для этой цели готовится новый сгусток по описанной ниже методике.
I. Осторожно открепите эксплантаты от старого сгустка плазмы и поднимите их с помощью двух катарактных ножей.
II. Перенесите эксплантаты в лунку предметного стекла, заполненную раствором Хэнкса с 2% сыворотки и промойте.
III. После промывки отсосите эксплантаты в пипетку с широким носиком и перенесите на свежий сгусток плазмы.
IV. Разделите и распределите эксплантаты по поверхности сгустка, используя анатомические иглы и катарактный нож.
V. Удалите избыток жидкости, используя капиллярную пипетку.
3.3.4. Комбинация методов сгустка и плотика
Эксплантаты сначала помещают на полоски линзовой бумаги (см. разд. 7.1) либо ацетата вискозы, смоченные раствором Хэнкса, и эти полоски помещаются на сгусток. Этот метод не снижает жизнеспособность и рост эксплантированных тканей, предотвращает погружение ткани в разжижающуюся плазму и облегчает процесс смены среды. Вместо индивидуального подъема каждого эксплантата можно поднимать сразу все эксплантаты, расположенные на плотике, промывать их раствором Хэнкса, подсушивать на стерильной фильтровальной бумаге и помещать на свежий сгусток.
Техника выращивания на часовых стеклах особенно удобна для исследований зачатков костной ткани птиц [6, 26, 27], для изучения дифференцировки эпидермиса и эпителия пищевода птиц и изменения этого процесса витамином А [28, 29]. Кроме того, этот метод нашел широкое применение при исследовании действия канцерогенных агентов, стероидных гормонов и витамина А и их взаимодействия в эмбриональных тканях человека, мыши и крысы. Используя эту технику, удалось показать, что стероидные гормоны необходимы для поддержания культур органов, являющихся их мишенями, и что канцерогенные агенты индуцируют предраковые изменения, подавляемые витамином А[30—32].
Этот метод имеет ряд ограничений. Эксплантаты часто разжижают .сгусток и погружаются в него, что ухудшает снабжение ткани кислородом. Сложность среды исключает проведение биохимических исследований, и длительность культивирования при использовании этого метода оказывается ограниченной. И хотя во многих экспериментах положительные результаты могут быть получены в течение короткого времени, решение дру-
гих проблем требует более длительного периода культивирования. При использовании метода сгустка плазмы продолжительность культивирования не превышает, как правило, 4 нед [33].
