Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Конки Д. -> "Культура животных клеток" -> 100

Культура животных клеток - Конки Д.

Конки Д., Эрба Э., Френши Р., Гриффитс Б. Культура животных клеток — М.: Мир, 1989. — 333 c.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка): kulturajivotnihkletok1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 136 >> Следующая

VII. После высушивания поместите стекла в светонепроницаемый темный ящик, содержащий пробирки с силикагелем, и установите в холодильник при 4 °С.
VIII. Рекомендуется экспонировать пробные предметные стекла в течение различного времени для выбора оптимального периода экспозиции. Оказались эффективными следующие времена экспозиции, которые можно выбирать в качестве отправной точки: 3Н-тимидин — 6—7 дней, 3Н-уридин — 8—10 дней, 3Н-лейцин — 8—10 дней.
10.4.4. Проявление
I. Используйте проявитель Кодак К 19.
II. Отфильтруйте раствор перед использованием.
III. Проявляйте 4—5 мин при 18—21 °С.
IV. Ополосните дистиллированной водой.
V. Фиксируйте в амфиксе (1 : 10) в течение 2—3 мин или до осветления пленки.
VI. Промойте и перенесите в осветляющий раствор (Кодак) на 2 мин.
VII. Промойте 5 мин проточной водопроводной водой и затем тремя сменами деионизированной или перегнанной в стекле воды.
10.4.5. Окрашивание
Стекла можно высушить, а можно перенести непосредственно из дистиллированной воды в краситель. Результаты в таком случае получаются лучше. Для окраски обычно используются гематоксилин-эозин или квасцовый кармин.
10.4.6. Интерпретация результатов
При микроскопическом обследовании метка проявляется обычно в виде темных зерен над ядром (3Н-тимидин, 3Н-ури-дин) или над цитоплазмой (3Н-лейцин). Если инкубацию с 3Н-уридином продолжить более 40 мин, то происходит частичное перемещение метки в цитоплазму.
Пленка эмульсии очень тонка и гомогенна, так что гистологическая структура ткани и изменения характера ее роста могут быть легко выявлены и сопоставлены с локализацией и степенью включения меченых предшественников.
Включение изотопов может быть оценено количественно, путем подсчета числа меченых и немеченых клеток, и результаты
могут быть представлены в форме относительного количества меченых клеток и его среднеквадратичного отклонения (индекс метки). Интенсивность включения можно оценивать подсчетом числа зерен над индивидуальной клеткой; результаты тогда представляются в форме среднего числа зерен на клетку и его< среднеквадратичного отклонения (количество зерен). Для оценки индекса метки используются более высокие концентрации изотопа для увеличения плотности зерен так, чтобы ядро стало совсем черным. Это облегчает подсчет меченых ядер. Для оценки количества зерен используется меньшая плотность зерен (20—30 зерен на клетку).
11. Количественная оценка результатов
Изменения морфологии, индуцированные химическими или физическими воздействиями, могут быть количественно оценены и отнесены к изменениям пролиферации или синтеза ДНК, РНК и белка. Среднее число эксплантатов на каждую точку должно быть не ниже 6.
Чтобы исключить влияние на результат возможных различий в разных участках эксплантата, рекомендуется использовать серийные срезы и просчитывать изменения либо на всех срезах, либо на каждом втором.
Так, например, чтобы оценить частоту гиперплазий, индуцируемых канцерогеном или митогеном, следует подсчитать количество гиперпластических и нормальных структур и представить результаты в форме относительного содержания гиперпластических структур и его среднеквадратичного отклонения.
Для определения частоты митозов проводится подсчет делящихся и интерфазных клеток на серийных срезах эксплантатов, инкубированных с колцемидом (2 мкг/мл) или другим агентом, вызывающим остановку деления клеток в метафазе, в течение
5 ч до фиксации. Результаты представляются как число митотических клеток, отнесенное к общему числу клеток, и его среднеквадратичное отклонение.
Синтез ДНК, РНК и белка оценивается путем подсчета меченых и немеченых клеток на радиоавтографах серийных срезов эксплантатов, проинкубированных с соответствующими предшественниками. Результаты также представляются в форме относительного числа меченых клеток и его среднеквадратичного отклонения.
Этот метод обеспечивает получение достоверных результатов, воспроизводимых в повторных экспериментах. Для подтверждения результатов бывает достаточно одного или двух повторов.
12. Преимущества и недостатки органной культуры
В органной культуре различные компоненты ткани, их пространственная взаимосвязь и функциональная активность при определенных условиях сохраняются in vitro. Особую важность имеет сохранение стромы, поскольку она представляется незаменимой для поддержания роста и дифференцировки эпителия. Благодаря этому ткань в органной культуре оказывается более физиологичной экспериментальной моделью по сравнению с культурой клеток. И вопреки имеющемуся мнению, приготовление органной культуры не более сложная процедура, чем ведение культуры клеток.
Эмбриональные органы или их зачатки развиваются in vitro примерно таким же образом, как и in vivo. Эпителий в присутствии стромы растет и дифференцируется в свойственной ему манере и продуцирует специфические секреторные белки. Органы, зависимые от гормонов, такие как предстательная и молочная железы, влагалище и матка, сохраняют чувствительность к гормонам и способность к ответам на гормоны in vitro. Эндокринные органы (яичники, семенники, надпочечники и гипофиз) продолжают секретировать in vitro специфические гормоны.
Предыдущая << 1 .. 94 95 96 97 98 99 < 100 > 101 102 103 104 105 106 .. 136 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed