Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
в) Цитоплазма эпителия — розовая.
г) Базальная мембрана — ярко-синяя.
д) Коллаген — синий.
е) Хрящевая ткань — синяя.
10. Радиоавтография
Уровень включения изотопа в ткань, определяемый путем экстракции и подсчета радиоактивности, свидетельствует об общем включении. Судить о характере распределения изотопа между клетками и различными компонентами ткани по этим данным мы не можем. Такая информация может быть получена с помощью радиоавтографии, которая точно указывает на включение в различные компоненты ткани и составляющие их клетки, а также мечение их ядер и цитоплазмы. Распределение метки может быть изучено путем световой микроскопии специально обработанных срезов.
Первоначально радиоавтографы готовились в соответствии с методом Дониач и Пелк [58] с использованием накладывающихся пленок Кодак AR 10, но впоследствии всеобщее применение нашел метод погружения в эмульсию. Последний метод занимает меньше времени и обеспечивает лучшее разрешение
благодаря значительно меньшей толщине пленки. Ниже будет приведено описание метода погружения в эмульсию, а метод накладывающихся пленок будет рассмотрен в гл. 9.
10.1. Обработка мечеными препаратами
Удалите эксплантаты с полосок бумаги для чистки оптики или миллипоровых фильтров и погрузите в 2 мл свежей среды при 37 °С.
I. Синтез ДНК. Добавьте 3Н-тимидин до концентрации
1 мкКи/мл (37 кБк/мл). Хорошо перемешайте и инкубируйте культуру в течение 5 ч.
II. Синтез РНК. Добавьете 3Н-уридин до концентрации
10 мкКи/мл (370 кБк/мл). Хорошо перемешайте и инкубируйте 40 мин. При таком коротком времени инкубирования радиоактивной оказывается в основном быстрометя-щаяся РНК ядер. При более длительном периоде инкубации возрастает радиоактивность цитоплазмы за счет рРНК и вышедших из ядра м РНК.
III. Синтез белка. Добавьте 3Н-лейцин до концентрации
10 мКи/мл (370 кБк/мл). Хорошо перемешайте и инкубируйте 40 мин.
10.2. Фиксация
В конце инкубации достаньте эксплантаты из среды и промойте их тщательно раствором Хэнкса для удаления невклю-чившегося радиоактивного материала. Для фиксации поместите в смесь спирта и уксусной кислоты (1 часть ледяной уксусной кислоты и 3 части 80%-ного этанола) на 25 мин. Затем проинкубируйте по 1 ч в двух сменах 10%-ного формалина.
10.3. Обезвоживание и заключение
Применяется та же процедура, что описана в разд. 9.2, но срезы готовятся толщиной 4 мкм.
10.4. Процедура заливки
10.4.1. Материалы и аппаратура
Эмульсия Илфорд К5 для ядерных исследований [5] в форме геля. Хранится в холодильнике при 4°С. Сохраняется в течение
6 нед после начала использования. Неоткрытую упаковку можно хранить 3 мес и более.
2 небольших лабораторных стакана.
Стеклянная или пропиленовая кассета и ложка.
Пинцеты.
Пробные предметные стекла.
Штатив для высушивания.
Темный пластиковый ящик.
Силикагель.
Перегнанная в стекле вода.
10.4.2. Приготовление эмульсии
I. Вскройте контейнер с эмульсией в темной комнате с безопасным красным светом с фильтром Кодак.
II. Стеклянной или пластиковой ложкой перенесите эмульсию в химически чистый лабораторный стакан в количестве, достаточном для одноразового использования.
III. Расплавьте эмульсию на водяной бане при 40—42°С.
IV. После расплавления заполните эмульсией стеклянный контейнер на две трети и долейте доверху водой, перегнанной в стекле, предварительно нагретой до 40—42 °С.
V. Закройте контейнер и один-два раза переверните.
VI. Установите контейнер в водяную баню и дайте постоять 1—2 мин до погружения препаратов.
10.4.3. Нанесение эмульсии
I. Перед погружением предметных стекол со срезами осветлите их в ксилоле и проведите через смесь ксилола с этанолом (50 : 50) и серию спиртов со снижающейся концентрацией (100, 90, 70, 50 и 30%) по 2 мин в каждом. Перенесите стекла в дистиллированную воду.
II. Кислоторастворимые предшественники ДНК, РНК и белка
могут быть удалены ледяной 100%-ной трихлоруксусной
кислотой (2 раза по 10 мин), после чего препараты сле-
дует трижды промыть ледяной дистиллированной водой.
III. Стекла в дистиллированной воде перенесите в водяную баню и промойте 1—2 раза водой, перегнанной в стекле. Выньте стекла и дайте стечь воде, но не допускайте высыхания препаратов.
IV. Вначале опустите в эмульсию пробные предметные стекла, чтобы убедиться в полном расплавлении эмульсии и ее гомогенности. При рассмотрении на безопасном свете стекла должны быть покрыты тонкой равномерной сероватой пленкой.
V. Опустите в эмульсию опытные стекла. Выньте из эмульсии, прислоните стекло к краю кассеты так, чтобы стек избыток эмульсии. Затем переверните стекло и установите его в выемку штатива для высушивания (стекла должны сушиться в вертикальном положении).
VI. Предметные стекла высушиваются в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение 5—10 мин при использовании фена.
