Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
I. Образцы тканей могут быть получены путем аутопсии либо при проведении хирургической операции. Органы должны быть освобождены от окружающей ткани и доставлены в лабораторию погруженными в ледяную среду Лейбови-ча. С равным успехом может быть использована и другая среда при условии, что в ней поддерживается постоянный pH. Для предотвращения бактериального заражения в эту среду рекомендуется добавлять антибиотики; в лаборатории ткань следует промывать в такой же среде. Антибиотики нужно использовать в концентрации, вдвое превышающей таковую при культивировании ткани (например, 200 ед./мл пенициллина и 200 мгк/мл стрептомицина) .
II. Проведите дальнейшую подготовку ткани, освободите ее от жира, стромы и подлежащих мышц и разрежьте на фрагменты подходящих для культивирования размеров. Эти размеры оказываются разными для разных тканей. Так, эксплантаты бронхов имеют размер 2 см2, молочной железы и шейки матки 0,5—1 см2, а пищевода 1 см2.
III. Поместите эксплантаты на дно пластиковой чашки Петри для культуры ткани (60 мм), к которому они приклеиваются, и залейте 3—5 мл среды. Органы, содержащие эпителий и строму, располагайте таким образом, чтобы стро-мальная сторона приклеивалась ко дну, а свободная поверхность была представлена эпителием.
Количество эксплантатов на чашку варьирует в зависимости от типа ткани и желания исследователя. Можно выращивать в каждой чашке 6—9 эксплантатов шейки матки, 2—6 эксплантатов молочной железы и 6—18 эксплантатов пищевода. Эти цифры не являются абсолютными, и другие исследователи могут выбрать для своих опытов как другие размеры эксплантатов, так и другое их количество на чашку.
8.2. Среда
Наиболее подходящей для длительного поддержания тканей человека в органной культуре оказалась среда CMRL 1066, в которую обычно добавляются эмбриональная телячья сыворотка, гормоны и антибиотики. Рекомендуется следующий состав среды.
Среда CMRL 1066 (Gibco).
5% эмбриональной телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием.
2—4 мМ L-глутамин.
Бычий инсулин (1 мкг/мл) (см. табл. 7.1).
Гемисукцинат гидрокортизона (0,1 мкг/мл) (см. табл. 7.1) (Sigma)
Таблица 7.1. Долгоживущие культуры тканей человека
Продолжительность культивирования (мес)
Результаты
Бронхи [20] 4 После 6 нед снижение высоты цилиндрического
эпителия. Частичная потеря бокаловидных клеток, частичная метаплазия.
Молочная 6 Сохраняются лобулярное строение н типичный
железа [21] эпителий протоков.
Сохраняется секреторная активность с изменениями, связанными с менструальным циклом. Пищевод [22] 4 Сохранение признаков чешуйчатого эпителия
подтверждается световой и электронной микроскопией.
Шейка 5 Жизнеспособность эпителия подтверждается рематки [23] зультатами анализа ультраструктуры и мито-
тической активности. После 4 нед отмечается частичная потеря секреции слизи и очаговая метаплазия
Инсулин является ростовым фактором, и в экспериментах, в которых единственным кри-тернем эффекта служит изменение пролиферации клеток, инсулин может маскировать эффект. Поэтому в таких экспериментах .рекомендуется не использовать инсулин или снижать его концентрацию (например, до 10 нг/мл).
Гидрокортизон в рекомендуемых концентрациях (0,1 мкг/мл) подавляет действие канцерогенных агентов [57] и, следовательно, непригоден при изучении канцерогенеза. В этих случаях он должен быть удален из среды или его концентрация снижена в 20 раз.
Пенициллин (100—300 ед./мл) (Glaxo).
Стрептомицин (100—300 мкг/мл) (Glaxo).
Фунгизон (Squibb) (5 мкг/мл) или гентамицин (Schering) (100 мкг/мл).
Для культивирования гормон-зависимых органов в среду следует добавлять специфические гормоны (так, для молочной железы прогестерон, эстрадиол, альдостерон и пролактин добавляются в среду постоянно или в течение 28 сут для имитации менструального цикла [21]).
8.3, Инкубация
Эксплантаты инкубируются при температуре 36,5 °С.
I. Разместите чашки с эксплантатами и 3,5 мл среды на индивидуальные лотки и установите лотки в камеру с контролируемой атмосферой (Bellco). На каждом лотке можно разместить до 60 чашек.
Рис. 7.9. Легкое эмбриона человека. Влияние 3,4-бензпирена. 1 — Живая культура легкого эмбриона человека после 2 нед роста в нормальной среде; виден организованный рост. Обратите внимание иа вырастание новых бронхиол на краю эксплантата. Увеличение 19Х. 2 — Бронхиолы при большем увеличении после 2 нед роста в контрольной среде. Азановое замещение. Увеличение Х243. 3 — Индукция гиперплазии. Гиперпластические бронхиолы видны после 2 нед роста в присутствии 3,4-бензпирена. Видны мелкие плотно расположенные клетки и поверхностный слой секреторного эпителия. Гематоксилин-эозин. Увеличение 342Х- Пищевод эмбрионов крыс. Слизистая трансформация эпителия витамином А. 4—Пищевод, выращиваемый в течение 1 нед в контрольной среде. Обратите внимание на толщину эпителия и кератииовые волокиа. Окраска ШИК после гидролиза эла-стазой. Увеличение 281X, 5 — Пищевод, выращиваемый в течение 1 нед при избытке витамина А. Кератии отсутствует. Сформировались бокаловидные клетки, содержащие слизь. Окраска муцикармином. Увеличение 281X.
