Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
V. Промойте железу ледяной средой, перенесите в лунку предметного стекла с той же средой и держите там до начала препарирования. Для одной группы экспериментов требуется не менее 6 желез.
VI. Перенесите железы на стеклянную пластинку для препарирования.
VII. Очистите железы от окружающих жировой и соединительной тканей с помощью пары ножей Сванн-Мортона.
VIII. Разделите две доли железы, перерезав соединительную ткань между ними.
IX. Проведите дальнейшее препарирование, не разрезая доли (что может привести к регенеративной гиперплазии раневых поверхностей), а разделяя слабым надавливанием на меньшие дольки. Эти маленькие дольки размером 2Х2Х Х2 мм готовы к дальнейшей эксплантации.
Следите за тем, чтобы в ходе препарирования ткань не высохла; она может приклеиться к стеклу.
7.2.2. Трахея
Получение ткани от мышей и крыс в возрасте 2—5 сут.
I. Зафиксируйте животное булавками на небольшой корковой подложке и тщательно промойте шкурку 70%-ным этанолом.
II. Вскройте тонкими ножницами кожу и грудную клетку, оттяните ребра и обнажите трахею. Ее легко выявить по хрящевым кольцам.
III. Освободите трахею с помощью двух часовых пинцетов. Один пинцет поддерживает орган, а второй отделяет его от лежащего ниже пищевода путем возвратно-поступательных движений.
IV. После отделения приподнимите трахею часовым пинцетом и отрежьте тонкими ножницами.
V. Сполосните орган ледяной средой, перенесите в лунку предметного стекла с той же средой и держите там до начала препарирования.
VI. Перед эксплантацией перенесите трахеи на стеклянную пластинку, отрежьте проксимальный и дистальный концы и разрежьте пополам с помощью пары ножей Сванн-Мортона. Полученные половинки длиной около 1,5—2 см экс-плантируются в виде трубочек.
7.2.3. Кожа
Ткань обычно получают от крысиных или мышиных эмбрионов в возрасте 17—18 сут.
I. Зафиксируйте эмбрионы с помощью булавок на небольшой корковой подложке и смочите их кожу холодной средой.
II. С помощью пинцета и тонких ножниц удалите кожу с брюшка in toto, ополосните ее холодной средой и перенесите на стеклянную пластинку. Во время этого процесса кожа сокращается и стремится к скручиванию, так что
в ходе препарирования ее нужно время от времени разглаживать.
III. В случае необходимости соскоблите подкожный жир, чтобы препарат состоял из двух главных слоев: собственно кожи и эпидермиса.
IV. Разделите препараты на фрагменты размером 3x3x4 мм с помощью двух ножей Сванн-Мортона.
7.3. Среда
Изучалась эффективность различных сред в поддержании структуры и функции эксплантированных органов, в том числе среды Ham F-12, среды Waymouth 752/1, среды CMRL 1066, среды 199 и среды Trowell Т8.
Среда Trowell оказалась пригодной только для относительно короткого культивирования взрослой ткани. Кроме того, эта среда содержит большое количество инсулина (50 мкг/мл), что может мешать действию гормонов и маскировать эффекты других ростовых факторов. По этим причинам среда не нашла применения.
Между другими средами не обнаружили существенных различий, так что, как правило, можно использовать среду 199 либо без добавок, либо с добавлением сыворотки и небольшого количества инсулина.
Рекомендуется использовать среду следующего состава: Среда 199 на растворе Эрла.
Сыворотка новорожденного теленка, инактивированная нагреванием (в концентрации 5% при изучении действия гормонов и 10—15% при изучении канцерогенеза).
Инсулин (0,5—1,0 мкг/мл).
Антибиотики и противогрибковые агенты: пенициллин
(250 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), фунгизон (1,4 мкг/мл).
7.4. Эксплантация
I. Поместите полоски бумаги для чистки оптики или милли-поровые фильтры на стеклянное предметное стекло или дно чашки Петри и смочите их 1—2 каплями среды.
II. Перенесите 6—8 фрагментов предстательной железы или
4 половинки трахей на полоски с помощью двух катаракт-ных ножей. Для предстательной железы взрослых животных лучше использовать бумагу, а миллипоровые фильтры— для трахей новорожденных. При отсутствии бумаги можно работать с миллипоровыми фильтрами и при культивировании предстательной железы.
III. Перенесите полоски с эксплантатами на сетки в культуральные камеры с помощью часовых пинцетов и заполни-
те камеры примерно 3 мл среды; среда должна доходить до верхнего уровня сеток и обеспечивать смачивание поверхности эксплантата, не допуская его погружения в среду.
Эксплантация кожи оказывается более сложной процедурой из-за того, что эксплантат иногда закручивается. Это можно преодолеть, придавливая дермальную сторону эксплантата смоченными полосками миллипорового фильтра. Препарат расправляется и слегка приклеивается к субстрату. Перед переносом на сетки полоски переворачивают, так что рост эскпланта-та кожи происходит при обращении эпидермиса наружу.
Соединения, действие которых предстоит исследовать, добавляют в среду до желаемой концентрации на этой стадии эксплантации. Впрочем, они могут быть внесены в среду раньше и затем храниться при —20 °С вплоть до использования. Последний вариант обеспечивает более жесткий контроль экспериментальных условий и оказывается менее трудоемким.
