Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
5.2. Постоянные линии клеток (выход и жизнеспособность)
Другие процедуры требуются при «лассификации клеток, разделяемых из постоянных клеточных линий, состоящих из однородных клеток. Элютриационным центрифугированием
Номер канала Номер канала
Рис. 5.5. Кривые проточной цитометрии клеток HL60. На первом рисунке показана кривая для асинхронно делящихся клеток, а на последующих — кривые для различных фракций, выделенных при указанных скоростях протока.
можно получить фракцию клеток, находящихся в определенных фазах клеточного цикла, что трудно сделать на основе чисто морфологических методов.
Чтобы отличить клетки в S-фазе от клеток, находящихся в других фазах цикла, можно использовать включение тимидина, меченного тритием, в ДНК с последующим выявлением изотопа (радиоавтографией или с помощью сцинтилляционпого счетчика). Однако в настоящее время наиболее точный и полный анализ разделяемых клеток может быть проведен с помощью проточной цитометрии (см. гл. 6).
Ниже приведены два примера, иллюстрирующие разрешение метода и жизнеспособность разделенных клеток.
5.2.1. Клетки HL60
Профиль проточной цитометрии для асинхронно делящихся клеток HL60 приведен на рис. 5.5. Этот профиль типичен для постоянных линий клеток, хотя "клетки HL60 гетерогенны по содержанию ДНК. 2-108 таких клеток были загружены в ро-
Рис. 5.6. Кривые проточной цнтометрии эритролейкозных клеток в фазе-Gl и тех же клеток, культивированных в течение указанного времени. Маленький пик в нескольких первых каналах представляет эритроциты птиц, добавленные в качестве маркера, от которого можно отмерять расстояние до пика G1. Пик G2 находится на двойном расстоянии.
тор, вращающийся со скоростью 2000 об/мин при скорости протока 15 мл/мин. В качестве буфера для элютриации была выбрана полная среда RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 20 °С. При скорости протока 20 мл/мин была получена фракция клеток, находящихся по данным проточной цитометрии в фазе G1. При скорости протока 25 мл/мин отбиралась популяция, содержащая клетки фазы G1 и ранней фазы S (не показано). При скорости протока 30 мл/мин отбиралась чистая популяция клеток, находящихся в середине S-фазы, а при скорости 35 мл/мин — клетки в поздней S-фазе и в фазе G2 с небольшой примесью клеток из фазы G1. Общий выход клеток, каж правило, превышал 80%, и в разделительной камере оставались агрегаты клеток всех фаз клеточного цикла.
5.2.2. Эритролейкозные клетки
Для оценки жизнеспособности разделяемые эритролейкозные клетки в фазе G1 могут быть культивированы в элютриаци-онном буфере (полная среда) при 37,5 °С. Через различное время культивирования отбираются пробы для анализа в проточном цитометре. Получаемые профили (рис. 5.6) свидетель-
ствуют о синхронном прохождении клетками клеточного цикла между 2 и 7 ч. Прохождение цикла заканчивается к 12 ч (время одного цикла), когда клетки повторно входят в фазу G1 (не показано).
Таким образом, элютриационное центрифугирование представляет собой процедуру, обеспечивающую получение минимально травмированной синхронной популяции клеток при небольших значениях сил тяжести. Метод позволяет избежать повреждения клеток при их осаждении и осмотических эффектов центрифугирования в градиенте плотности. При загрузке в ротор до 109 клеток можно провести разделение за относительно короткое время.
6. Дальнейшие перспективы
При использовании стандартной камеры общий выход специфических типов клеток после загрузки 109 клеток не всегда оказывается адекватным. Постепенная загрузка увеличивает не только выход клеток, но и продолжительность разделения. Иногда обходная камера заменяется на вторую разделительную, устанавливаемую последовательно, однако это не дает реального преимущества по сравнению с двумя последовательными циклами элютриации в одной разделительной камере. Использование системы двойных камер, действующих параллельно, требует существенной модификации конструкции ротора, которая, впрочем, не ограничивает число разделительных камер двумя.
В последнее время удалось резко увеличить возможности разделения большого количества клеток при сохранении чистоты фракций [12]. Новый ротор-элютриатор большой емкости JE-10X, выпускаемый фирмой Beckman, имеет камеру с 10-кратно увеличенным объемом. Результаты предварительных исследований показывают, что при центрифугировании в этом роторе сохраняется чистота выделяемых фракций и достигается 10-кратное увеличение выхода клеток.
7. Втгодарности
Экспериментальные исследования проведены благодаря субсидии, полученной от Центра по изучению рака.
Литература
1. Lindahl Р. Е. (1948). Nature, 161, 648.
2. Lindahl P. Е. (I960). Cancer Res., 20, 841.
3. McEvan С. R., Stallard R. W., Jukos E. T. (1968). Anal. Biochem., 23, 369.
4. Pretlow Т. G., Weir Е. Е„ Zettergren J. G. (1975). Int. Rev. Exp. Pathol.,
14, 91.
