Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Когда клетки откачиваются из резервуара, как показано на рис. 5.4, тангенциально действующие силы Кориолиса влияют на небольшое начальное количество клеток в камере, вызывая неупорядоченную элютриацию клеток всех размеров [10]. В качестве альтернативы используется инъекция шприцем концентрированной клеточной суспензии в среду для элю-триации непосредственно перед входом в ротор. Попадание в камеру такого большого образца клеток приводит к установлению равновесия инерциальных и гидродинамических сил.
4. Тмюичвокий протокол
4.1. Стерилизация аппаратуры
Элютриация может проводиться без стерилизации аппаратуры, если не требуется последующее культивирование полученных клеточных фракций. В противном случае должны быть проведены следующие операции. До сбора аппаратуры следует проавтоклавировать все соединительные трубки и узлы, предназначенные для соединения резервуаров с буферами и образцами клеток и для сбора клеточных фракций.
Производители приборов рекомендуют стерилизацию полностью собранных аппаратов путем прокачивания 6%-ного раствора перекиси водорода. Можно использовать также 0,2%-ный раствор диэтилпирокарбоната или Цидекс (Arbrook, Livingstone, UK). В ряде случаев можно проводить автоклави-рование (121 °С в течение 1 ч) всего ротора в сборе, за исключением сальника разделительной камеры. Виниловый сальник следует стерилизовать отдельно в 6%-ной перекиси водорода. Дезинфекция аппарата путем прокачивания этанола через систему при включенных цепях центрифуги нежелательна вследствие опасности возгорания из-за поврежденных или искрящих электрических контактов.
I. Соберите аппаратуру, как показано на рис. 5.4, но емкости с буфером и образцом клеток замените на емкости с 200 мл Цидекса в каждой.
II. При неподвижном роторе включите насос и установите подачу стерилизующего агента в систему со скоростью 40 мл/мин. Переключайте трехходовые краны для заполнения всех соединительных трубок и емкостей.
III. Отверните манометр для удаления воздуха из его шейки и затем верните его в нужное положение.
IV. Отделите ловушку пузырьков и освободите ее от воздуха, опуская постепенно маленькую иглу до нижнего уровня сосуда. Установите ловушку пузырьков, как показано на рис. 5.4.
V. Для удаления воздуха из ротора включите центрифугу и доведите скорость вращения ротора до 1000 об/мин. Отключите насос и затем выключите центрифугу. Вновь включите насос, когда скорость вращения ротора станет ниже 500 об/мин. Пузырьки воздуха должны выйти из ротора. Повторяйте процедуру, пока пузырьки не перестанут выходить. Давление на манометре должно быть ниже 10 фунт/дюйм2 (1,67 бар).
VI. Выключите ротор и насос и оставьте Цидекс в системе на ночь.
VII. После стерилизации пережмите обе трубки для поступления жидкости и подсоедините их в асептических условиях к сосудам, содержащим по 1000 мл стерилизованной дистиллированной воды каждый. Снимите зажимы.
VIII. Прокачайте воду через систему и соберите Цидекс для повторного использования.
4.2. Калибровка скорости тока
I. Включите центрифугу и разгоните ротор до 2000 об/мин.
II. После стабилизации скорости ротора включите стробоскопический контроль и подрегулируйте частоту вспышек так, чтобы разделительная камера «остановилась» и была бы ясно видна через смотровое окно.
III. На основании показаний стробоскопического счетчика определите точную скорость ротора.
IV. Установите потенциометр насоса на произвольную (низкую) скорость и определите скорость тока, собирая оттекающую жидкость в мерный цилиндр в течение 2 мин.
V. Постепенно повышайте положение потенциометра и на основе полученных данных постройте для микропроцессора график или программу зависимости между положением потенциометра и скоростью тока жидкости.
4.3. Загрузка образца
I. Используя в случае необходимости стерильную технику, пережмите входной соединительный шланг и отделите его от дистиллированной воды, соблюдая предосторожности от попадания в систему воздуха.
II. Подсоедините входные трубки к контейнерам с буфером для элютриации объемом 1 ли 100 мл. В качестве такого буфера можно использовать сбалансированные солевые
растворы, если не предполагается культивировать получаемые элютриацией клетки. Больше всего для элютриа-ции подходит полная ростовая среда, которая затем может быть использована для повторного культивирования. Среду следует держать в водяной бане при 37°С, как показано на рис. 5.4.
III. Снимите зажимы и, правильно установив трехходовой кран, как можно полнее засосите во входные трубки порцию среды в 100 мл. Этот буфер заместит воду в переходных трубках. Переключите трехходовой кран для прокачивания через систему буфера из литрового контейнера до полного вытесненения воды из системы. Сохраните большую часть литрового образца в качестве буфера для элютриации.
IV. Пережмите входную трубку и перенесите ее с контейнера с порцией 100 мл на контейнер с образцом клеток, как показано на рис. 5.4. Снимите зажим. Подходящим образцом может быть 200 мл суспензии, содержащей 2 -10s клеток в полной среде.
