Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Юст. вращение
Лазерная оптика
Зеркало
- вращение Юст. смещение
Г Регулировка положения потока
г*
^Сопло
Истечение ^\^фит>Тр
^ Ли>па ^>^оНуСйровка
^'"юстТ П, гЮст. смещение .^вращение *
" Оптическая заслонка
Детектор светорассеяния и оптика
Все оси в точке пересечения взаимно перпендикулярны
Рис. 6.4. Прибор FACS440. Оптические и механические юстировки блока регистрации.
(от 1 до 1,5°) и широкоугловое рассеяние (1—15°). Детектор рассеянного света способен различать клетки по размерам от
0,3 мкм до предела апертуры используемого отверстия.
Флуоресцентное излучение (350—600 нм) предварительно-окрашенных клеток регистрируется многоэлектродными ФЭУ. Эмиссия специфических красителей отбирается с помощью фильтров и зеркала, расщепляющего луч.
Оцениваемая нижняя граница чувствительности детекторов флуоресценции составляет 2000 эквивалентов молекул ФИТЦ на клетку.
При использовании в каналах флуоресцентного света поляризационных фильтров в качестве анализаторов можно провести определение вертикального и горизонтального компонентов поляризации флуоресценции. Выпускается также FACS440 с двухлазерной оптической скамьей. Эта модификация позволяет одновременное использование двух лазерных лучей для двойного рассеяния и тройного возбуждения флуоресценции и сортировки. В этом случае требуется добавление третьего канала регистрации флуоресценции.
При использовании этой двухлазерной установки можно, например, применять освещение с длинами волн 488 и 600 нм для последовательного возбуждения флуоресцеина, фикоэрит-рина и техасского красного. Два независимых луча пересекают поток клеток в вертикально отстоящих друг от друга точках, так что клетка вначале пересекает луч с длиной волны 488 нм, а затем — с длиной волны 600 нм. Каждая клетка генерирует при этом три флуоресцентных сигнала, два в первом луче и один во втором. Сигналы, индуцируемые двумя лазерами, разделены в пространстве и во времени, и промежуток между ними равен тому времени, которое необходимо клетке, чтобы пройти от первого участка пересечения лазерного луча с потоком до второго. Этот промежуток времени позволяет электронике проводить раздельный анализ сигналов. Пространственное разобщение обеспечивает регистрацию сигнала каждым детектором с оптимальным соотношением сигнал/шум.
2.2.2. Сортировкв клеток
Условия сортировок определяются главным образом выбором верхнего и нижнего порогов для светорассеяния и эмиссии флуоресценции вместе или по отдельности. В установке имеются две пробирки для сбора фракций (рис. 6.5), что позволяет проводить одновременную сортировку клеток по двум параметрам. Остальные клетки собираются в центральный резервуар.
Камера для анализируемого образца содержит 5 мл жидкости с концентрацией клеток до 5•1О6 клеток/мл. Для более
концентрированных суспензий (когда прибор используется как средство обогащения суспензии клетками нужного типа) необходимо лишь, чтобы концентрация клеток, предназначенных к отбору, не превышала 5-106 на 1 мл. Существенно также, чтобы детектируемые сигналы, на которых основан критерий отбора, превышали фоновые сигналы от клеток, отбрасываемых в ходе сортинга.
Фс-гировна Какал оптических
светорассеяния засяонон
Регулировка сопла и потопа
Устройство Регулятор &льного> контроля
Двржатепъ образца
Оптическая
скамья
Лазер
Рнс. 6.5. Блок регнстрацнн FACS440
Поставляемые сопла и фильтры обеспечивают сортировку клеток с диаметром до 30 мкм. Клетки с диаметром до 100 мкм могут анализироваться в системе в специальном режиме.
После входа в систему поток пересекает лазерный луч на уровне примерно на 250 мкм ниже кончика отверстия. Благодаря такому расположению время прохождения клетки от участка пересечения с лучом лазера до участка образования капли минимально. Одним из результатов этого является максимально возможная скорость сортировки при сохранении высокой чистоты. Кроме того, отсутствие отверстий между участками анализа и сортировки позволяет избежать «аких-либо изменений скорости тока клетки. Другой важной особенностью является исключение возможности загрязнения клеток, прошедших участок лазерного облучения и светособирательной оптики.
Капли, генерируемые электромеханическим преобразователем, заряжаются с помощью положительных или отрицатель-
Измеритель скорости анализа
Осциллограф
Дисплей
данных
Управление анализом и сортировкой
Панель выпора параметров Выбов отношения
Панель
управления-
счетчиками
Управляющая
клавиатура
Два гибких магнитных диска
Блок питания лазера
Блок
компенсации
сигналов
Флуоресценции
