Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 6.6. Блок электронного управления FACS440.
ных импульсов, прилагаемых к потоку в момент ее отрыва. Отклонение достигается при прохождении заряженных капель между съемными высоковольтными электродами. Для обеспечения необходимой точности сигнал об отклонении синхронизируется образованием капли.
В этой системе может быть достигнута скорость сортировки до 5000 клеток/с. Сортировка лимитируется «эффектами совпа-
дения». В|клад «эффектов совпадения» снижается электронной схемой, прекращающей сортировку, когда клетки находятся слишком близко, чтобы их можно было разделить. Когда отбираемых клеток слишком мало (например, 1 на 104), то цепь отключения сортера выключается и могут достигаться более высокие скорости сортировки и анализа. Это обусловливает получение еще не чистого, но обогащенного образца, который может быть центрифугирован и повторно подвергнут сортировке с работающей цепью выключения, что приведет в конечном итоге к выделению чистой популяции клеток.
Клетки сохраняют высокий уровень жизнеспособности, и устройство FACS обеспечивает сбор клеток в стерильных условиях.
Чистота полученных фракций зависит от концентрации клеток, скорости анализа и числа отклоняемых капель. Возможно достижение чистоты от 95 до 99%. При сортировке со скоростью 2000 клеток/с и отклонении одной капли выход клеток составляет около 85%, а при отклонении двух и более капель— 90%. Результаты могут варьировать в зависимости от способа получения образца, скорости поступления клеток, размеров форсунки и скорости образования капель.
2.2.3. Обработка сигнала и дисплей
Микрокомпьютер FACS440 обеспечивает и анализ высоты пиков, и функции рамочного отбора. Все контрольные и рамочные команды устанавливаются с помощью кнопок на передней панели. Микрокомпьютер снабжен 4096 каналами памяти в качестве стандарта, и каждый канал имеет емкость 106 отсчетов. Данные выдаются на двуосевой экран осциллоскопа и могут быть выражены в виде точечного графика или однопараметрической гистограммы. С помощью разъемных переходов FACS440 может быть соединен с двухкоординатным самописцем, линейным принтером и внешним компьютером (серии Консорт). Экспериментальные результаты могут быть распечатаны в виде гистограммы через серийное соединение RS232 либо в форме необработанных данных через параллельный интерфейс.
3. Вывод данных
Оптические сигналы от проходящей через аппарат клетки
преобразуются фотоумножителем в аналоговые сигналы, ко-
торые обрабатываются различными блоками за время, сопоставимое со временем измерения, для получения величин площади под сигналом, его пикового значения и его ширины на высоте половины максимума. Первая величина позволяет от-
делять клепки с одной и той же общей флуоресценцией (одинаковая площадь под сигналом) от клеток с другим пико-м сигнала флуоресценции.
Выходное устройство аналоговой части выдает описательную цитограмму либо посылает сигналы в аналого-цифровой преобразователь, который переносит данные в многоканальный анализатор и сохраняет их.
Вычисления могут проводиться по одному, двум или трем параметрам, что обеспечивает коррелятивный анализ данных от одного или более детекторов на двухмерных или трехмерных гистограммах.
3.1. Описательные цитограммы
Аналоговые сигналы, производимые двумя ФЭУ (например, данные по светорассеянию и флуоресценции), собираются в осциллоскопе с памятью и представляются на его экране в виде двумерного графика, где каждая клетка представлена одной точкой (рис. 6.7, нижняя часть). Фокусы плотности на этих гистограммах могут представлять кластеры интересующих клеток, и могут быть задействованы пороговые системы для подсчета числа «леток! или для запускания клеточного сортера, отбирающего клетки из интересующих областей дисплея.
3.2. Гистограммы
Гистограммы производятся многоканальными анализаторами установок либо в форме двумерных гистограмм (рис. 6.8) (интенсивность флуоресценции против числа клеток), либо в форме трехмерных гистограмм (флуоресценция и светорассеяние против числа клеток). Если данные собираются одновременно с двух различных ФЭУ, то требуются более сложные многоканальные анализаторы. Трехпараметрические гистограммы могут также создаваться некоторыми компьютерами, откладывающими частоту распределения клеток по параметрам X, Y и Z. Количество клеточных параметров, определяемых одновременно, характеризует оснащение установки для проточной цитометрии.
3.3. Компьютерный анализ данных
Данные, собранные в многоканальном анализаторе, могут быть обработаны для получения статистических оценок, для проверки совпадения с теоретической моделью или для сравнения результатов с полученными ранее. Эти задачи решаются с помощью различного типа компьютеров, некоторые из которых содержат программное обеспечение, предназначенное для
Рис. 6.7. Клетки FHI (клетки кишечного эпителия эмбриона человека), окрашенные митрамицииом, как указано в тексте. На верхнем рисунке приведена зависимость числа клеток (ордината) от величины флуоресценции (абсцисса). На нижнем рисунке те же клетки представлены в форме точечной цитограммы: светорассеяние — по оси ординат, флуоресценция — по оси абсцисс (пороги флуоресцентного сигнала установлены шире, чем па верхнем рисунке). Данные получены с помощью Б. Д. Янг и Р. Силлар.
