Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
V. Установите скорость протока жидкости 12 мл/мин и доведите скорость вращения ротора до 2000 об/мин. Переключите трехходовой кран для всасывания клеток в разделительную камеру. Эти условия обеспечат удержание в камере всех частиц с диаметром выше 8 мкм. Если в этих условиях в образце будут эритроциты, они немедленно пройдут через камеру в собирательные сосуды.
VI. После загрузки более 95% объема клеток переключите трехходовой кран в такое положение, чтобы опять подключить к системе буфер для элютриации. Когда затем все клетки пройдут через ловушку пузырьков, переключите местный трехходовой кран для отключения ловушки от системы.
4.4. Элютриация дискретных клеточных популяций
Существуют два метода изменения равновесия двух противоположно направленных факторов (скорости седиментации в поле центробежных сил и скорости тока жидкости), действующих на клетки, суспендированные в разделительной камере. Можно либо снизить скорость центрифугирования, либо увеличить скорость протока.
Хотя в центрифуге J2-21 возможна модификация стандартного потенциометра контроля скорости, обеспечивающая точную регулировку, торможение ротора может приводить к снижению скорости ниже установленного уровня. Кроме того, при каждом новом установленном значении скорости для отбора дискретной фракции клеток следует проводить регулировку
стробоскопа, чтобы камера опять стала видимой. Поэтому на практике лучше оставлять скорость вращения ротора постоянной и варьировать скорость протока.
I. С помощью регулятора насоса увеличьте скорость тока жидкости примерно на 5 мл/мин^ Точное значение, необходимое для отмучивания специфической фракции клеток, в первом приближении подбирается эмпирически. Приблизительные значения могут быть получены из выражения
где F — скорость тока жидкости в мл/мин, X—0,0511 (стандартная камера) или 0,0378 (камера Сэндерсона), D — диаметр клетки в мкм и RPM — скорость вращения ротора в об/мин.
Это уравнение отражает условия на границе элютриации клеток и используется в руководстве Beckman для построения номограммы, связывающей скорость тока, размер клетки и скорость вращения ротора. Эти же данные могут быть модифицированы с использованием программы микропроцессора путем включения фактора корреляции, полученного из соотношения между вычисленным и действительным размером клеток, разделяющихся при данной комбинации скорости тока жидкости и скорости вращения ротора.
II. Следите за границей клеток, передвигающейся центростремительно в разделительной камере, и за прохождением клеток через проточную ячейку. Используя при необходимости стерильные условия, собирайте клеточные фракции. Для сбора всех клеточных фракций требуется — 150 мл буфера для элютриации.
III. Когда граница клеток опять становится видимой в разделительной камере и проточная ячейка освобождается от клеток, вновь проведите ступенчатое повышение скорости протока и соберите следующую фракцию разделенных клеток, как описано выше.
Элютриация специфической фракции клеток при заданных скорости жидкости и скорости вращения ротора оказывается воспроизводимой при условии, что разделение проводится с использованием одного и того же буфера, при той же температуре и при той же начальной концентрации клеток в камере. Постоянная скорость вращения ротора и скорость протока могут сочетаться со ступенчатым увеличением плотности элютри-ационной среды- для увеличения разрешения фракционирования. Обратите внимание на то, что все содержимое камеры может быть откачано, если отключить ротор от системы. Это может
оказаться удобным, если производится концентрирование како-го-либо специфического типа клеток в камере, например клеток белого ряда цельной крови. Прекращение прокачивания приводит к преципитации клеток в камере.
5. Сбор клеток и интерпретация данных
Информация, получаемая из опытов по элютриации, зависит от того, использовалась ли в качестве начального образца гетерогенная или однородная популяция клеток.
5.1. Гетерогенные клеточные популяции (достижение чистоты клеточных фракций)
Целью эксперимента по элютриации в этих случаях является обычно разделение и сбор различных типов клеток. Например, нормальные клеши хозяина могут быть отделены от опухолевых клеток. Анализ типа (типов) клеток, присутствующих в каждой фракции, может быть достигнут классическими цитологическими методами (фиксация и окрашивание). Результаты морфологических исследований показывают степень целостности «леток, особенно при использовании механическоГг или ферментативной дезагрегации органа или солидной опухоли для получения начальной суспензии клеток, (см. гл. 1 и
6). Обогащение клеточных фракций может быть далее оценено измерением размера «леток в анализаторе размера частиц Каултер биохимическими методами, культивированием в мягком агаре или другими испытаниями колониеобразования in vitro, анализом способности клеточных фракций к образованию колоний in vivo.
Примером простого разделения «леток из смеси может служить элютриация эритроцитов птиц и эритролейкозных клеток мыши. Эритроциты отделяются при условиях, используемых для загрузки смешанной клеточной популяции (2000 об/мин, скорость тока 14 мл/мин). Более крупные опухолевые клетки удерживаются в камере и отделяются позднее (2000 об/мин, скорость тока 25 мл/мин). Начальная смешанная популяция, состоящая на 55% из эритроцитов и на 45% из опухолевых клеток, при элютриации дает две фракции, первая из которых более чем на 99% состоит из эритроцитов, а вторая более чем на 97% — из эритролейкозных клеток.
