Культура животных клеток - Конки Д.
ISBN 5-03-000359-2
Скачать (прямая ссылка):
Интенсивность флуоресценции на нлетку (ДНК на клетку)
Рис. 6.8. Окрашивание ДНК пропидийиодидом. (Данные получены от Л. Мораска, Институт Марио Негри, Милан.)
наиболее распространенных типов анализа. При наличии оператора, обеспечивающего программирование, возможно использование более дешевого набора оборудования.
4. Подготовка образцов
Проточная цитометрия регистрирует один или более сигналов от каждой индивидуальной частицы, проходящей через световой луч. Следовательно, клетки суспендируют до одиночных, и в суспензии не должно содержаться агрегатов или клеточных обломков. Краситель должен быть специфичным и не вытекать из клеток в среду.
4.1. Суспензии клеток из различных тканей
4.1.1. Образцы крови
Реагенты и материалы Гепаринизированные пробирки.
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса или ФСБ в модификации Дюльбекко.
Фиколл-Гипак или его эквивалент 1,077 г/см3 (Flow Laboratories, Pharmacia, Nygaard).
Универсальные контейнеры (Sterilin) или центрифужные пробирки объемом 25 мл.
I. Клетки крови не требуют дезагрегации, но фибрин может образовывать сгустки, препятствующие току жидкости в системе и способствующие агрегации одиночных клеток. Поэтому свежая кровь должна собираться в ге-паринизированные пробирки.
II. Разведите кровь четырьмя объемами ФСБ или раствора Хэнкса и нанесите 10 мл разведенной крови на слой из 5 мл Фиколла-Гипак в универсальном контейнере или центрифужной пробирке на 2,5 мл. Благодаря этой процедуре вы избавитесь от эритроцитов.
III. Центрифугируйте при 1600 об/мин в течение 20 мин.
IV. В конце центрифугирования одноядерные клетки образуют видимый слой на границе раздела ФСБ и Фиколла. Отсосите этот промежуточный слой и ресуспендируйте в 10 мл буфера.
V. Дважды повторите центрифугирование при 1200 об/мии по 10 мин.
VI. Суспендируйте конечный осадок в растворе Хэнкса до концентрации 106 клеток/мл и анализируйте проточной цитометрией.
4.1.2. Дезагрегация солидных тканей
Ферментативная дезагрегация
Ферменты, используемые для дезагрегации ткани, можно подразделить на три класса: ферменты, действующие на волокнистые структуры (коллаген или эластин) [1]; ферменты, гидролизующие мукополисахариды, например гиалуронидаза; неспецифические протеолитические ферменты (трипсин, проназа и диспаза). При использовании ферментативной дезагрегации следует принимать во внимание много факторов: среда, в которой растворены ферменты, продолжительность воздействия ферментов на ткань, температура, pH, концентрация используемого фермента, а также метод остановки действия фермента [2].
I. Трипсин. 0,25%-ный раствор грубого трипсина [3] способен дезагрегировать большое количество тканей [4—9]; после продолжительной обработки трипсином при 37 °С жизнеспособными оказываются 90—95% клеток [9]. Трипсин часто используется в комбинации с хелатирую-щими агентами (см. ниже).
II. Проназа. Получаемая из Streptomyces griseus проназа представляет собой другой фермент, также часто исполь-
зуемый при работе со многими тканями [10—;14]. В большинстве описанных случаев используется 0,1%-ный раствор проназы [12]. Результаты многих исследований показывают, что с одинаковым эффектом можно обрабатывать ткани высокими концентрациями проназы в течение короткого времени и низкими концентрациями фермента в течение длительного времени. Подобно трипсину, про-наза используется в комбинации и с другими ферментами, например ДНКазой [14].
III. Коллагеназа. Используется при дезагрегации многих тканей, таких как мышиная меланома, мышиные опухоли тучных клеток, лимфогранулематоз человека, опухоли селезенки и яичников человека [8, 16, 17].
В грубых препаратах коллагеназы могут содержаться другие протеазы, и даже очищенный препарат содержит примесь гиалуронидазы [1]. Обработка очищенной коллагеназой может не приводить к получению одноклеточной суспензии, особенно при действии на эпителиальные клетки, и потому должна использоваться в комбинации с трипсином или проназой. Коллагеназа применяется в различных концентрациях — от 100 ¦ до 1000 ед./мл в культуральной среде в течение 15 мин при 37°С. Бактериальная коллагеназа, как и проназа, не подавляется сывороткой, так что возможно длительное (до нескольких суток) воздействие фермента в полной среде с сывороткой.
Хелатирующие агенты
Другим подходом .к получению суспензии клеток из солидной ткани является обработка ткани хелатирующими агентами, обычно в сочетании с ферментами. При использовании только хелатирующих препаратов выход интактных клеток в суспензию оказывается ниже, чем после ферментативной обработки. К наиболее часто используемым хелатирующим агентам относятся ЭДТА, этилеигликоль (2-аминоэтиловый эфир)-п, nl-тетраацетат (ЭГТА) и цитрат.
ЭДТА связывает ионы Са2+ и ионы Mg2+ и используется в концентрациях 0,01—0,10 М. ЭГТА используется в концентрации 0,1 мМ. Оба хелатирующих агента растворяются в ФСБ или солевом растворе без Са2+ и Mg2+. Цитрат используется в концентрации 40 мкМ [19, 20].
