Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
Этот интеграл можно вычислить, используя точные выражения для Ра и W.
Для состав-
ляющих, поляризованных в параллельном и перпендикулярном направлениях,
имеем
/|,(г) = [(1/3) + (4/15)е_6Ввр'(3 cos2 ?, - l)/2]c_(/lF
(8.70)
f±(t) = [(1/3) - (2/15)<r6D-p'(3 cos2 ? - l)/2]e~'/rF (8.71)
Таким образом, хотя неполяризованное излучение затухает как одна
экспонента, каждая из поляризованных компонент затухает как сумма двух
экспонент. Если подставить (8.70) и (8.71) в выражение для степени
анизотропии флуоресценции A{t), то мы получим особенно простой результат:
A(t) = [/"(г) - /±(t)]/[/M(f) + 21 ±(t)] = (2/5)e-6ZV [(3 cos2 ? - l)/2]
(8.72)
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
109
Определим время вращательной корреляции тс как
тс = 1/60^ = Игидр, /кТ (8.73)
Тогда
A(t) = (2/5)?-</tc[(3 cos2 ? - 1)/2]
Заметим, что в пределе при t - 0 (8.72) переходит в (8.64).
Таким образом, степень анизотропии флуоресценции сферической молекулы
спадает по простому экспоненциальному закону. Измерение характерного
времени спада тс позволяет при известной вязкости рассчитать объем
гидратированной молекулы Игидр. Из уравнения (8.73) видно, что чем больше
молекула, тем медленнее спадает степень анизотропии флуоресценции. Это
довольно очевидный результат, поскольку чем больше молекула, тем
медленнее она вращается. На рис. 8.23 приведены данные по уменьшению
степени анизотропии для антранилоилхимотрипсина. Измеренное время
вращательной корреляции равно 15 не. Это - типичное значение для
небольших белков.
Химотрипсин-Ser1(r)3-ОН +
А
5 10 15 20 25
В Время, не
РИС. 8.23. Спад анизотропии флуоресценции антранилоила, ковалентно
присоединенного к Ser195 а-химотрипсина. А. Получение меченого белка. Б.
Экспериментальные данные по спаду интенсивности флуоресценции отдельных
поляризованных составляющих. В. График зависимости логарифма анизотропии,
полученный после математической обработки (свертки) экспериментальных
данных, которая позволяет исключить влияние формы возбуждающего импульса.
[L.Stryer, Science, 162, 526 (1968).]
110 ГЛАВА 8
Если молекулярная масса и удельный парциальный объем вещества известны,
из уравнения (10.10) можно найти Уг . Удельный объем типичных
гидратированных белковых молекул равен примерно 1 см" - г -1.
Следовательно, объем одной гидратированной молекулы составит M/N0 =
(М/6)-10"23 см 3. Вязкость воды при 20°С приблизительно равна 0,01 пуаза,
Т = 293 К, к = 1,38 • 10"16 эрг ¦ град -1. Таким образом, тс в
соответствии с формулой (8.73) составляет
тс = (0,01 • М - 10"23)/(6 ¦ 293 ¦ 1,38 ¦ 10 _16) = (М/2,4) • 10_12с
(8.74)
тс примерно равно 1нс на каждые 2400 дальтон молекулярной массы белка,
если молекула имеет приблизительно сферическую форму. [Уравнение (8.74)
справедливо также для глобулярных нуклеиновых кислот.] В эксперименте,
результаты которого приведены на рис. 8.23, мол. масса белка равна 25
000, следовательно, г с должно составлять 10 не. Различие между расчетным
и экспериментальным значениями скорости связано с тем, что по своей форме
молекула химотрипсина отличается от сферы. Частицы, имеющие вытянутую
форму, вращаются медленнее (см. гл. 10).
Чаще, однако, измеряют не характерное время спада, а среднюю
интенсивность параллельно и перпендикулярно поляризованных составляющих:
^11 - TF 1 io W* _ Тр 1 io
(8.75)
Эти средние значения интенсивностей наблюдаются при непрерывном
облучении. Полученные в таких опытах значения степени поляризации и
анизотропии называются статическими или стационарными. Чтобы найти их,
подставим (8.70) и (8.71) в соотношение (8.75):
- 7ц -1± _____________________3_________________
7ц + 11 1 + 10(1 + tf/tc)(3 cos2 ? - I)-1 (8-76)
А = t'i _ 3c0s2{~' (8.77)
+ 21± 5(1 -(- tf/tJ
Предположим, что измерения проводятся при столь высоких значениях ij /Т,
чтцза время жизни возбужденного состояния макромолекула не успевает
изменить ориентацию. В
этом случае tf /Fc = 0, и степень поляризации и анизотропия равна
р0 = з/[1 + 10(3 cos2 ? - 1)" •] = (3 cos2 ? - l)/(cos2 ? + 3)
(8.78)
А0 = (3 cos2 ^ - 1)/5 (8.79)
Эти выражения, дающие предельные значения степени поляризации и
анизотропии, идентичны выражениям (8.64) для жестких систем.
УРАВНЕНИЯ ПЕРРЕНА И ИЗМЕРЕНИЕ СТАЦИОНАРНОЙ СТЕПЕНИ ПОЛЯРИЗАЦИИ
Используя выражения (8.78) и (8.79), мы можем переписать уравнения (8.76)
и (8.77) в очень удобной форме:
1 Р - 1 '3 = (1 р0 - 1/3X1 + Т, /TJ = (ГР,, - 1 3X1 + тvkT Vrmpv) (8.80)
А = А0 '(1 + tf г,) = .4о '(1 + tfкТ V ,) (8.81)
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
111
Это так называемые уравнения Перрена. При подстановке выражения для
времени вращательной корреляции (гс) использовано уравнение (8.73).
Именно эти выражения для степени поляризации и анизотропии чаще всего
применяются на практике. При этом исследуют зависимость стационарной
поляризации или анизотропии раствора макромолекул от температуры Т или
вязкости у. При графической обработке данных, проводимой в соответствии с
уравнениями (8.80) и (8.81), должна получиться прямая, из наклона которой
