Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
тушителя (например, I-) подойти достаточно близко к хромофору.
Чтобы проанализировать влияние тушителя, рассмотрим уравнения (8.35) и
(8.36). Если сравнить интенсивность флуоресценции в присутствии (/•') и в
отсутствие (F0) тушителя (или соответствующие квантовые выходы ф и ф0)
при заданных концентрации и геометрии образца, то мы получим
F0/F = ф0/ф = |>F + к1С + fcis + /cq(Q)]/(/cF + kic + kis) (8.46)
= 1 + кц t0(Q)
где т q - время жизни хромофора в возбужденном состоянии в отсутствие
тушителя: 7 о = (Аг р + kic + kis)~l. Поскольку 70 можно измерить, из
графика зависимости Fq/F от (Q) мы получим Aq. В табл. 8.4 приведены
некоторые типичные значения констант бимолекулярного тушения. Константа
тушения для свободного хромофора равна - Ю10М "1 - с -1. Такая большая
скорость характерна для лимитируемых диффузией реакций. Для хромофоров,
связанных с белковыми молекулами или входящих в их состав, A:q иногда
оказывается существенно меньше.
СИНГЛЕТ-СИНГЛЕТНЫЙ ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ
Чрезвычайно интересным явлением, связанным с флуоресценцией, является
способность хромофоров, достаточно удаленных от данного хромофора,
находящегося в син-глетном возбужденном состоянии, вызывать тушение его
флуоресценции. В благоприятной ситуации это позволяет определить
расстояние между хромофорами вплоть до 80 А. Рассмотрим систему,
содержащую только одну пару разных хромофоров, спектры которых приведены
на рис. 8.18. Если эти хромофоры находятся на расстоянии нескольких
ангстрем друг от друга, то, как мы уже знаем, они могут взаимодействовать
по экси-
Таблица 8.4
ТУШЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТРИПТОФАНА ПРИ СТОЛКНОВЕНИИ С МАЛЫМИ МОЛЕКУЛАМИ 0
Белок Нативный белок (0,1 М Денатурированный белок
фосфатный буфер, pH 7) (добавлен 6 М гуанидин-к ¦ 10"9 М-1 ¦ с-1
хлорид)
4 к -10-9М-,-с-1
q
кислород иод кислород иод
Триптофан 12,0 3,9 5,9 1,9
и- Ас-Try-NH2 11,6 3,8 7,3 2,1
Пепсин 5,7 1,7 4,3 1,8
Трипсиноген 4,3 0,3 6,1 1,2
Карбоксипептидаза А 3,8 0,3 3,8 1,1
Карбоангидраза 2,6 0,2 4,2 1,0
J.R. Lakowicz, G. Weber, Biochemistry, 12, 4171 (1973).
7 84
98
ГЛАВА 8
X
X,
X
РИС. 8.18. Схематические спектры пары донор-акцептор, которая может быть
использована при исследовании сииглет-синглетного переноса энергии.
Представлены спектры поглощения лонора (/) и акцептора (II), а также
спектры испускания донора (III) и акцептора (IV). Область перекрывания
спектров (в пренебрежении множителем v ~ 4) закрашена.
тонному механизму (связанные осцилляторы). Это взаимодействие приводит к
расщеплению спектральных полос и их сдвигу. Однако нас интересует другая
ситуация.
Между двумя хромофорами могут существовать взаимодействия, даже если эти
хромофоры удалены друг от друга настолько, что никаких изменений в форме
их спектров не наблюдается. В этом случае мы имеем дело с так называемыми
слабыми взаимодействиями. Обозначим хромофор с более высокой энергией
первого возбужденного синглетного состояния буквой D (донор), а хромофор
с более низкой энергией - А (акцептор). Мы рассмотрим только основные
(Dc, Ас) и первые возбужденные синглетные состояния (Dfc, Aft) каждого
хромофора. Предположим, что донор перешел в возбужденное состояние. Он
будет очень быстро терять энергию возбуждения из-за внутренней конверсии,
пока не достигнет основного колебательного уровня первого возбужденного
синглетного состояния D6. При совпадении энергии излучения донора с
энергией поглощения акцептора даже очень слабое взаимодействие может
привести к возникновению резонанса:
Как показано на рис. 8.19, сразу после переноса и донор, и акцептор
находятся в возбужденных колебательных состояних, но из-за колебательной
релаксации быстро переходят на основной колебательный уровень.
Следовательно, даже если константа скорости прямого переноса (А:т) очень
велика, обратный перенос (А:_т) едва ли возможен. Резонансный перенос
энергии изменяет относительную заселенность возбужденных уровней доноров
и акцепторов. Возбуждение донора снимается, а акцептор переходит в
возбужденное состояние и, следовательно, может флуоресцировать. Такое
излучение акцептора называется сенсибилизированным. Заметим, что
хромофоры не обязательно должны принадлежать одной и той же молекуле.
Перенос энергии может происходить и между свободными молекулами в
растворе, если их концентрация достаточно высока, чтобы среднее меж-
молекулярное расстояние было не более 50 А.
Синглет-синглетный перенос энергии можно наблюдать несколькими способами.
Определим эффективность переноса (Е) как долю молекул донора D ь, которая
дезактивируется путем передачи энергии акцептору:
(8.47)
Е = kx/(A.T + /ip + к(r) + к?
(8.48)
Здесь к х - константа скорости переноса, а все остальные константы
относятся к процес-
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
99
РИС. 8.19. Дезактивация донора и возбуждение акцептора, участвующих в
резонансном взаимодействии, которое приводит к переносу энергии.
Колебательная релаксация (волнистые стрелки) происходит очень быстро и
