Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
предотвращает повторное взаимодействие, которое привело бы к дезактивации
акцептора и повторному возбуждению донора.
сам, связанным с донором. Из рис. 8.18 видно, что если систему возбуждать
при длине волны X,, а флуоресценцию наблюдать при длине волны Х2, то мы
будем регистрировать только флуоресценцию донора. Если приготовить два по
возможности абсолютно идентичных образца, различающиеся только тем, что
один содержит и донор, и акцептор, а другой - только донор, то Е можно
найти, сравнив параметры флуоресценции этих двух образцов. Используя
уравнения (8.36) и (8.48), легко показать, что
Фо+а/Фп = [*?/(*? + к?с + /сР + м] X [(*R + + *2)/*?] = 1 - ? (8-
49)
где + А - квантовый выход флуоресценции донора в присутствии акцептора.
Другой экспериментальный подход состоит в том, чтобы поддерживать длину
волны флуоресценции постоянной (Х4), а длину волны возбуждающего света
менять от Х3 до X,. Если система содержит только акцептор, то спектр
возбуждения будет близок к спектру поглощения акцептора, но если
присутствует также и донор, то в спектре возбуждения появится
дополнительный пик, соответствующий максимуму поглощения донора при длине
волны X j. Интенсивность этого пика будет зависеть от относительной
эффективности поглощения донора и акцептора в окрестности X j и от
эффективности переноса энергии (Е). При длине волны Х4 можно наблюдать
только флуоресценцию акцептора. Если геометрия экспериментальной
установки и способ возбуждения неизменны, мы можем использовать для
анализа результата формулу (8.42). Относительная флуоресценция образца,
содержащего только акцептор (длина волны возбуждения равна X,,
флуоресценция регистрируется при длине волны Х4), равна
Fa се ?дСаФа (8.50)
а для образца, содержащего и донор, и акцептор, она составит
?D+a ?АСАфА + ?dCd.E<^a (8.51)
В формуле (8.51) ed Cd пропорционально числу возбужденных молекул донора,
Е - это доля возбужденных молекул донора, передавших энергию акцептору.
Объединяя результаты двух измерений, можно определить Е:
?d+a/?a = 1 + (?dCd/?a?a)? (8.52)
Третий, независимый способ определения Е основан на сравнении времени
затухания флуоресценции донора в присутствии (rD А) и в отсутствие (тс)
акцептора. Можно показать (попробуйте проделать соответствуйте выкладки
сами), что
7*
100
ГЛАВА 8
td.a-td = 1 - ? (8.53)
Определение эффективности переноса энергии путем прямого измерения времен
жизни очень важно, так как на этой методике не сказывается наличие
тривиальных процессов, которые имитируют перенос.
Требование, предъявляемое к резонансному взаимодействию,
сопровождающемуся переносом энергии, состоит в том, чтобы спектр
поглощения акцептора перекрывался со спектром флуоресценции донора (рис.
8.18). Следовательно, в любой системе, в которой происходит перенос
энергии, может протекать процесс испускания фотона донором и пе-
репоглощения его акцептором. Этот процесс отличается от истинного
синглет-синглетного переноса энергии, так как при этом скорость излучения
донора остается неизменной. Тривиальное испускание и перепоглошение
фотонов выявляются при сравнении эффективностей переноса, полученных из
уравнения (8.53), с одной стороны, и из уравнения (8.49) или (8.52) - с
другой. Перепоглошение можно исключить, если работать с-растворами,
концентрация хромофора в которых не превышает 10"3 М.
ИЗМЕРЕНИЕ РАССТОЯНИЯ МЕЖДУ ХРОМОФОРАМИ ПО ДАННЫМ ОБ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ПЕРЕНОСА ЭНЕРГИИ
Чтобы из данных по переносу энергии получить информацию о структуре,
необходимо связать измеренную эффективность с расстоянием между двумя
хромофорами. Такая связь была получена Т. Фёрстером, который рассчитал,
что константа скорости переноса энергии равна
= (1/td>(K0/jR)6 (8.54)
где td - время жизни донора в возбужденном состоянии в отсутствие
акцептора. Зависимость А:т от R ~ь получается из-за возведения в квадрат
матричного элемента оператора диполь-дипольного взаимодействия, который
пропорционаленR ~3 (см. Дополнение 8.3). R0 - так называемое
характеристическое расстояние переноса, равное
R0 = 9,7 • 103 IiK^r4^)1'6 см, (8.55)
где
J = /ca(v)./d(v)v-4</v (8-56)
J - это интеграл перекрывания спектра испускания донора и спектра
поглощения акцептора (закрашенная область на рис. 8.18),/D -
нормированная интенсивность флуоресценции донора, которая входит в
уравнение (8.42), п - показатель преломления среды, разделяющей донор
и акцептор, Ф D - квантовый выход флуоресценции донора в
отсутствие акцептора, к2 - множитель, связанный с геометрией системы,
который зависит от ориентации донора и акцептора. Если и донор, и
акцептор свободны и успевают
много раз изменить свою ориентацию за время жизни возбужденного
состояния, то к2
приближается к своему предельному значению, равному Уз. [Вывод выражений
для величин, встречающихся в формулах (8.54)-(8.56), описан в Дополнении
8.3.]
Эффективность переноса можно найти, переписав формулы (8.48) в виде Е =
JtT/(JtT + + 1/td). Далее, подставляя кт из формулы (8.54), получим
