Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
переписав (8.57) в виде
R = Я0[(1 _ ?)/?] 1/6
Применяя формулы (8.55) и (8.56), удобно пользоваться спектрами,
представленными в виде зависимости соответствующего параметра от длины
волны, а расстояние выражать в ангстремах. Тогда (8.55) и (8.56)
приобретают вид
Д0= 8,79 ¦ 10'5(Тк2и 4фс)1/6 А
J = JeaWdUU^A
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
103
z
Образец /
РИС. 8.21. Система координат, использующаяся при анализе явления
поляризации флуоресценции.
ющий
свет
I \
Детектор
х
Остатки пролина образуют полипролин со спиралью типа II, что
подтверждается измерением КД. Поскольку расстояние между донором
(нафтилом) и акцептором (дансилом) легко вычислить из известных размеров
спирали, измеренные значения эффективности переноса можно непосредственно
сравнивать с рассчитанными по теории Фёрстера; согласие теории с
экспериментом оказалось великолепным (рис. 8.20). После этой пионерской
работы перенос энергии был использован для определения расстояния между
хромофорами в молекулах тРНК, иммуноглобулинах, родопсине и
олигопептидах, а также между белковыми субъединицами в различных
ассоциатах - от простых олигомерных белков до рибосом. Самое трудное в
этих экспериментах - специфическое включение в исследуемую структуру двух
флуоресцирующих хромофоров. Чтобы провести полный набор измерений,
необходимо приготовить три образца. Они должны быть по возможности
идентичными и различаться лишь тем, что один содержит только донор,
другой - донор и акцептор, а третий - только акцептор.
Перенос энергии играет важную роль при анализе спектров флуоресценции
обычных белков. Спектр флуоресценции тирозина перекрывается со спектром
поглощения триптофана. Хотя R0 для данной донорно-акцепторной пары
составляет только 9 А, это все же сравнимо со средним расстоянием,
ожидаемым для наиболее близко расположенных соседних пар тирозин-
триптофан в глобулярных белках. Следствием этого является сильное тушение
флуоресценции тирозина; почти вся наблюдаемая флуоресценция (как мы
упоминали ранее) связана с триптофаном.
Информацию о размерах, форме и внутренней подвижности макромолекул можно
получить, измеряя соответствующие параметры линейно поляризованных
составляющих излучения образца, возбуждаемого плоскополяризованным
светом. На рис. 8.21 приведена схема типичного поляризационного
эксперимента. Свет падает вдоль оси х и регистрируется в направлении у.
Падающий свет поляризован вдоль оси z . Измеряется интенсивность двух
составляющих излучаемого света: /| - интенсивность составляющей,
поляризованной вдоль оси Z, и /х - интенсивность составляющей,
поляризованной вдоль
ПОЛЯРИЗОВАННАЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ
104
ГЛАВА 8
оси х. Составляющая, которая распространялась бы вдоль оси .у и
одновременно была поляризована вдоль этой оси, отсутствует, поскольку
световая волна, как и любые электромагнитные волны, является поперечной.
ПОЛЯРИЗАЦИЯ В ЖЕСТКИХ СИСТЕМАХ
Рассмотрим вначале жесткую изотропную систему; такой системой может быть,
например, замороженный раствор флуоресцирующих молекул или хромофоры,
жестко связанные с хаотически ориентированными молекулами столь большого
размера, что за времена, характерные для флуоресценции (обычно < 100 не),
не происходит заметных молекулярных вращений. Обозначим через р вектор
момента перехода для поглощения одного хромофора в лабораторной системе
координат. Вероятность того, что этот хромофор перейдет в возбужденное
состояние, пропорциональна (jx ¦ Е)2. Поскольку вектор Е параллелен оси
z, эта вероятность равна cos2 б, где б - угол между р и осью г.
Следовательно, возбуждаться будут главным образом молекулы с моментами
переходов, ориентированными преимущественно вдоль оси z¦ Это явление
называется фотоселекцией.
Чтобы объяснить явление поляризации флуоресценции, нам необходимо
вычислить вероятность возбуждения молекул с заданной ориентацией, а затем
найти вероятность испускания ими света, поляризованного в заданном
направлении. Воспользуемся сферической системой координат (рис. 8.21). До
возбуждения относительное число молекул с р, ориентированным в интервале
углов от б до б + d6 и от ф до ф + с!ф, пропорционально sinвс1вс1ф.
(Наличие множителя sin б связано с тем, что вероятность встретить
молекулы, ориентированные перпендикулярно оси г, значительно больше, чем
молекулы, ориентированные параллельно ей.) Как уже упоминалось,
вероятность возбуждения молекулы, ориентированной под углами б и ф,
пропорциональна cos2 в. Следовательно, относительное число возбужденных
молекул среди ориентированных в интервале от б до в + d6 и от ф до ф +
d<j> есть
Р(в, ф) d6 Фф X cos2 в sin в dO dф (8.58)
Доля возбужденных молекул с ориентацией в интервале от б до б + d6 и от ф
до ф + d<j> составляет
W{6, ф) d6 dф = Р(в, ф) dO dф j J*o dO dф cos2 в sin в (8.59)
Интеграл, стоящий в знаменателе, представляет собой обшее число
возбужденных молекул. Его можно преобразовать при помоши подстановки х =
cos б, dx = -sin б. В результате получим 47г/3, так что уравнение (8.59)
