Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
находят молекулярный объем р) при условии, что известно время затухания
флуоресценции (tf). Пересечение прямой с осью ординат при T/i\ - 0 дает
предельную анизотропию или поляризацию. На рис. 8.24 приведен
соответствующий график для химо-трипсина. Предельное значение степени
анизотропии (=0,3) свидетельствует о практически жестком закреплении
флуоресцентной метки. Время вращательной корреляции (15 не) согласуется
со значением, полученным из данных по измерению зависимости спада степени
анизотропии от времени. Экспериментально найденное значение достаточно
близко к теоретическому, оцененному ранее для жесткой сферической
белковой молекулы.
Уравнения (8.65)-(8.81) справедливы только для сферических молекул. Если
последние по своей форме ближе к жесткому эллипсоиду, а не к сфере,
результаты существенно усложняются. Коэффициент вращательной диффузии,
входящий в уравнение (8.65), теперь становится тензором. Спад анизотропии
флуоресценции описывается не уравнением (8.72) с одной экспонентой, а
выражением, содержащим сумму до пяти экспонент. Эти экспоненты зависят не
только от размеров и формы молекул, но также от ориентации моментов
переходов хромофоров относительно осей эллипсоида. В принципе при наличии
достаточно точных данных о зависимости спада степени анизотропии от
времени можно было бы получить весьма полное представление о форме
молекулы и способе связывания с ней хромофора. На практике попытки
описать полученные данные при помощи более чем двух экспонент обычно
оказываются превышением точности эксперимента. В таком случае
единственный выход состоит в построении более или менее правдоподобных
моделей, удовлетворяющих данной структуре, и в установлении степени их
соответствия экспериментальным данным. Одно можно утверждать несомненно:
для вытянутого эллипсоида кажущееся тс больше, чем для сферы.
Следовательно, если известна молекулярная масса, как правило, можно
получить некоторую информацию об отношении осей.
Может оказаться, что полученное значение степени анизотропии меньше, чем
теоретически рассчитанное для сферической молекулы известной молекулярной
массы. Это обстоятельство указывает на гибкость макромолекулы как целого
или на нежесткое присоединение хромофора к макромолекуле. Иногда эти
эффекты можно различить, если провести поляризационные измерения при
высоких значениях Т/т). Кгидр хромофора составляет приблизительно 1% или
меньше от объема типичной макромолекулы. Если хромофор свободно сочленен
с макромолекулой, его время вращательной корреляции будет составлять
примерно Иоо от соответствующего времени для макромолекулы. При низкой
вязкости за небольшой по сравнению с характерным временем затухания
флуоресценции период времени хромофор успевает принять все возможные
ориентации. Если угол, на который поворачивается хромофор, достаточно
велик, наблюдаемая поляризация будет равна нулю. Если, однако, быстрое
движение хромофора происходит в ограниченном диапазоне углов вращения,
некоторая остаточная поляризация все же будет наблюдаться. Чтобы хромофор
смог принять все возможные ориентации, он должен участвовать в движении
макромолекулы как целого. Таким образом, при низкой вязкости зависимость
остаточной поляризации от Т/ц будет отражать движение макромолекулы.
Экстраполяция графика зависимости Р ~ 1 от Т/ц к Т/ц - 0 позволяет найти
конус углов, в котором происходит быстрое движение хромофора.
При достаточно большой вязкости макромолекула становится неподвижной.
Хромофор все еще имеет некую свободу движения, и это будет проявляться в
виде более сильной
112
ГЛАВА 8
РИС. 8.24. Статическая поляризация флуоресценции антранилоил-5ег|95-а
химотрипсина (см. рис 8.23). Данные для этого графика Перрена получены
при постоянной температуре 20°С; вязкость изменяли добавлением к водным
белковым растворам глицирина. (R.P.Haugland, L.Stryer. In: Conformation
Biopolymers, vol.l, ed. G.N.Ramachandran, New York, Academic Press, 1967
)
РИС. 8.25. Зависимость степени анизотропии от температуры или вязкости в
координатах Перрена для образца, в котором флуоресцентная метка,
связанная с макромолекулой, обладает ограниченной свободой вращения.
Экстраполяция линейного участка графика к 77ij = О (штриховая прямая)
дает кажущееся значение А0, существенно меньшее, чем истинное значение.
Различие между этими двумя значениями служит мерой интервала значений
углов, в пределах которого происходит вращение метки относительно
макромолекулы.
зависимости поляризации от T/tj при больших jj . В результате получится
нелинейный график Перрена (см. рис. 8.25). Таким образом, поляризация
может четко указывать на гибкость либо тех участков молекулы, где
находится место связывания хромофора, либо макромолекулы как целого. Это
важная информация, которую часто очень трудно получить при помощи
гидродинамических методов измерения поступательного движения, таких,
например, как седиментация.
Помимо анализа молекулярного движения поляризационные исследования могут
