Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
лиза легко доступной ДНК проводят препаративное получение смеси
гомологичных олигонуклеотидов или пуриновых и пиримидиновых
олигонуклеотидов. Далее с помощью комбинирования известных
хроматографических методов (ИОХ, ТСХ, бумажная хроматография)
фракционируют очень сложный по составу частичный гидролизат ДНК на более
простые фрагменты [80-82], которые подвергаются более тонкому
хроматографическому разделению на обращенно-фазовой колонке [83, 84]. Как
правило, для элюирования используют летучие двухкомпонентные буферные
системы: А^0,1 М ацетат аммония (pH 7,5), Б^60% метанола, 40% воды. На
аналитической колонке с нук-леосилом С)8 (11,2X0,46 см, 7,5 мкм, время
разделения 20 мин) выход соответствующих фрагментов ДНК составляет 0,5-ЗЛ
единиц оптической плотности (260 нм). На таком же уровне находится выход
и в случае ферментативного синтеза фрагментов генов. Идентификация
хроматографических пиков и выбор желаемых олигонуклеотидов среди многих
других является сложной задачей и часто дает неоднозначный результат.
Методы хроматографии и отпечатков пальцев позволяют, однако, преодолеть
указанные трудности, а также определить степень чистоты олигонуклеотидов
и их последовательность. Олигонуклеотиды, полученные при
хроматографическом разделении гидролизатов ДНК, по своим показателям ни в
чем не уступают синтетическим. Недостатком метода является ограниченная
возможность получения олигонуклеотидов с заранее заданной
последовательностью. Однако следует отметить, что синтетический метод
получения олигонуклеотидов гораздо более трудоемок.
9.4.3. Продукты рестрикции ДНК
ВЭЖХ (RP С-5, pH 12) использовали для препаративного разделения коротких
фрагментов комплементарных цепей ДНК, полученных в результате действия
эндонуклеазы рестрикции Нае III [85]. Свойства Нае III-фрагментов
pRZ2flHK изучали для того, чтобы выяснить, почему некоторые из них
связываются на колонке с RP С-5 более прочно, чем можно было ожидать на
основании их длины [86]. Очищенные фрагменты анализировали на их
нуклеотидный состав, а также с помощью седиментацион-ного анализа в
градиенте плотности CsCl или CS2SO4. А-Т-обо-гащенные фрагменты
элюируются при более высоких концентрациях солей, чем фрагменты такой же
длины, но не содержащие эквивалентного количества А-Т. Кроме того,
исследования по де-натурационному картированию, проведенные с помощью
электронной микроскопии, показывают, что А-Т-обогащенные фрагменты
двигаются иначе, чем G-C-обогащенные, что вызывает увеличение
удерживания. Существует по крайней мере еще
480 Глава 9
один фактор, влияющий на разделение фрагментов рестрикции ДНК на фазе
RPC-5. Фрагменты, содержащие связанные регуляторные белки, а также
генетические регуляторные участки, элюируются позже, чем можно
предположить на основании их размера.
Порошкообразный кель-F без какого-либо покрытия обладает рядом
уникальных свойств как неподвижная фаза в обращенно-фазовой ВЭЖХ
олигонуклеотидов и фрагментов рестрикции ДНК [87]. Вещества элюируются в
градиенте ацетонитрила (О-18 об. %) в 0,1 М водном растворе
триэтиламмонийацетата. В отличие от разделения на RP С-5 олигонуклеотиды
не элюируются растворами соли, а порядок элюирования фрагментов
рестрикции строго соответствует длине цепи. Кель-F представляет собой
дешевый и химически инертный материал, хорошо заполняющий колонку.
Результаты, полученные на колонках с кель-F, отличаются высокой
воспроизводимостью. Емкость колонки с кель-F меньше, чем с RPC-5, однако
выходы разделяемых веществ в первом случае выше (при нанесении микрограм-
мовых количеств пробы выход обычно выше 50%).
9.4.4. Фрагменты РНК
З'-Концевые фрагменты 16S-pPHK Е. coli выделяли и очищали с помощью
электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1 SDS-Na, и
анионообменной хроматографии на колонке с пермафазой ААХ, что позволило
фракционировать смеси как моно-, так и полинуклеотидов (длиной до 80
нуклеотидов) [88]. С помощью ВЭЖХ были разделены низкомолекулярные
фрагменты РНК, полученные в результате гидролиза фосфодиэстеразой
змеиного яда. Четыре наиболее распространенные нуклеозид-5'фосфаты были
идентифицированы по времени их удерживания, а их относительное содержание
хорошо коррелировало с составом оснований анализируемого фрагмента. Был
осуществлен также анализ продуктов гидролиза РНКа-зой Т1 49-нуклеотидного
фрагмента. Получены также УФ-спектр и кривая плавления очищенного
фрагмента. Известен метод экспресс-анализа олигонуклеотидов, полученных
из модифицированной phe тРНК дрожжей после гидролиза РНКазой Т1,
осуществляемый с помощью разделения на аминопропилсили-кагеле, причем
установление фрагментов основывалось на данных нуклеозидного анализа с
помощью разделения на С^-сили-кагеле [89].
9.4.5. тРНК
Для разделения аминоацил-тРНК и незаряженных тРНК (животных или
бактериальных) использовали неподвижную фазу на основе
полихлортрифторэтилена с нанесенным фенилборатом.
Таблица 9.1. Наблюдаемые времена удерживания азотистых оснований,
