Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 196

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 190 191 192 193 194 195 < 196 > 197 198 199 200 201 202 .. 296 >> Следующая

результаты анализа.
476 Глава 9
Разделение олигорибонуклеотидов адениловой, цитидиловой и уридиновой
кислот проводят на колонках с лихросорбом RP-8, RP-18 и лихросорбом
диолом, а также на колонке с недавно синтезированным анионообменником
диметиламиносиликагелем (DMA-силикагель) [75]. Если разделение проводили
на колонках с лихросорбом RP-8 и RP-18 при элюировании водными буферными
растворами (К2НРО4/Н3РО4), время удерживания олигонуклеотидов
увеличивалось с уменьшением числа нуклеотидных звеньев, т. е. с
увеличением гидрофобности олигонуклеотидов. Элюирование олигонуклеотидов
на лихросорбе диол происходило в той же последовательности, однако это
вызвано тем, что разделение осуществляется по принципу ГПХ.
Предполагается, что разделение олигонуклеотидов на ДМА-силикагеле
происходит за счет электростатического взаимодействия между заряженными
группами разделяемых веществ и неподвижной фазы. Обсуждался вклад ионного
и молекулярного взаимодействий в удерживание разделяемых веществ.
Для разделения и очистки сложных смесей олигорибонуклеотидов
разработан метод [76], в котором используют колонки с тонкодисперсным
пористым силикагелевым носителем с привитыми октадецилсилильными
группами. Элюирование осуществляют в градиенте ацетонитрил/вода/ацетат
аммония. Время разделения составляет 5-15 мин с ошибкой по абсолютному
времени удерживания менее 1 % и по относительному - примерно 0,1%. На
одной колонке разделяют смесь, состоящую из мононуклеозидов,
мононуклеотидов и высших олигомеров (до 20-меров). Предел обнаружения
оснований составляет ~1 пмоль (в большинстве случаев ~ 1 нмоль). При
счастливом совпадении обстоятельств можно использовать аналитические
колонки для очистки ~1 мг олигонуклеотида (в течение одного анализа
длительностью 10-30 мин).
9.4.2. Олигонуклеотиды с изомерными последовательностями
Короткие олигонуклеотиды из ДНК и РНК были разделены в соответствии с
составом их азотистых оснований на анионообменной ВЭЖХ-колонке с
партисилом-10 АХ при элюировании триэтиламмонийацетатным буфером [77].
Таким способом удалось разделить пятнадцать из шестнадцати
дезоксинуклеозид-монофосфатов (рис. 9.10) и все шестнадцать
динуклеозидмоно-фосфатов (рис. 9.11).
Этим же методом успешно разделены пары изомерных нуклеотидов; так,
например, коммерческий препарат дезоксидинук-леотидов разделен на 13
фракций. Хорошее разрешение получено при разделении
дезокситринуклеозиддифосфатов, являю-
t, мин ¦
Рис. 9.10. Разделение дезоксирибонуклеозндмонофосфатов [77].
Колонка: 500X3 мн (внутр. диаиетр); неподвижная фаза: партисил 10 SAX;
элюент:
10 м.М триэтиламмоннйацетат (pH 3,1); температура; 60 °С; обнаружение:
при 260 нм. /- (dCh: 2 - d(А-С); 3 - d(T-С); 4 - d(C-Т); 5 -d(G-С); 6 -
d(С-G): 7 - (dA)2; в - d(T-A); 9 - d(A-Т); 10 - d(G-A); //-d(A-G); 12 -
(dT)2; 13 - d (Ci-T); 14 -
d(T-G); /J-(dGh.
t.MMH
Рис. 9.11. Разделение динуклеозидмонофосфатов [77].
1 - (Ch: г - А -С: 3 - С - А; 4-1} - С; 5-С -U и (А),; 6 - G - С; 7-C-G;
В - и -А; " - А - U; 10 -Q - А; // - А - G; 12- (Ubj 13 - G - U; 14 - U -
G; 15 - (Gh.
478 Глаьа 9
Рис. 9.12. Разделение тринуклеозидднфосфатов, выделенных из продуктов
деструкции РНК щелочной фосфатазой н панкреатической РНКазой \7T\-
¦Колонка: 500XU мм( внутр. диаметр); неподвижная фаза: партиснл 10 SAX;
элюент: от 30 мМ (pH 3.1) до 400 мМ (pH 3.4) триметиламмонийацетата.
линейный градиент. 80 мии; температура: 60 аС: обнаружение: при 260 им.
/ - а_а_С; 2 - G - А - С* 3 - А - G - С; 4 - A - A - U; 5-G-G-С: 6 -
G - А - U; 7 - А - G - U; 8 - G - G - U.
щихся продуктами разложения ДНК тимуса телят ДНКазой I, активированной
Мд2+-щелочной фосфатазой (рис. 9.12).
Известны примеры полного разделения большого числа олигонуклеотидов,
имеющих изомерные последовательности. Последовательность оснований в
индивидуальных компонентах смеси после разделения определяли путем их
гидролиза препаратом змеиного яда и фосфодиэстеразы селезенки и
последующего ВЭЖХ-разделения продуктов (нуклеотидов). Восемь тринукле-
озиддифосфатов, выделенных из продуктов деструкции РНК щелочной
фосфатазой и панкреатической РНКазой, были также разделены в соответствии
с составом оснований. Описываемый метод отличается быстротой и дает
хорошее разделение. Большинство изомеров были разделены. Более того,
триэтиламмо-нийацетат, применяемый для элюирования, может быть легко
удален из элюата методом лиофильной сушки, что облегчает дальнейший
анализ последовательности элюируемых веществ. Порядок элюирования
изомеров подчиняется правилам, которые будут обсуждены ниже.
Короткие фрагменты ДНК с идентифицированной структурой, которые
находят широкое применение в генной инженерии, обычно получают путем
сложного синтеза. Альтернативная возможность (на примере 150 фрагментов
ДНК), предложенная в работах [78, 79], состоит в следующем. Путем
частичного гидро-
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 479
Предыдущая << 1 .. 190 191 192 193 194 195 < 196 > 197 198 199 200 201 202 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed