Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
RP С-5 [90], отличающейся высокой воспроизводимостью. Минимум 8000
распадов на пробу необходимо иметь, чтобы осуществить анализ в устройстве
с проточной ячейкой для определения числа распадов; для обнаружения же
образцов с меньшей радиоактивностью может быть использован жидкостной
сцинтилляционный счетчик. Этот метод предложено применять для
исследования изменений в тРНК-комплементах из дифференцированных клеток
или клеток, выращенных в разных условиях.
9.4.6. Анализ последовательности олигонуклеотидов и РНК
Простой метод анализа последовательности небольших олигонуклеотидов
предложен в работе [91]. Он основан на одновременной качественной и
количественной идентификации мономеров, полученных в результате гидролиза
олигонуклеотидов фосфодиэстеразой змеиного яда, после разделения на
анионообменной колонке с пермафазой ААХ или на колонке с обращенной фазой
RP С-5 [92]. Таким образом была установлена точная последовательность
пяти олигомеров: p(ACCUCC),
p(CUGUU), p(AGGA), д(АТТАСС) и a(GGAAT) [91].
Описан быстрый автоматический метод определения последовательности
синтетического дезоксидекануклеотида a(TATCAAGTTG) [93], основанный на
использовании ВЭЖХ и гидролиза фосфодиэстеразой змеиного яда.
В работе [94] проведена оптимизация условий четкой идентификации,
точного количественного анализа и хорошего разделения на ВЭЖХ-колонках с
AS-пеллионексом SAX и AL-пел-лионексом WAX рибонуклеозидов, моно- и
олигорибонуклеоти-дов, полученных в результате гидролиза
полирибонуклеотидов некоторыми рибонуклеазами. РНКазный гидролизат 5S-
pPHK
Азотистые основания, иуклеозиды и нуклеотиды 483
t. мин
Рис. 9.13. Разделение смеси олигодезоксирибонуклеотидов, содержащей
синтетический декамер д(С-С-G-А-Т-А- -Т-С-G-G) (пик 1) [116]. Колонка:
250X4,U мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: партисил SAa; элюент:
растворитель А -
1 мМ КН2РО< (pH 6.3) в смеси формамид/НгО (60 : 40 по объему),
растворитель Б - 300 м.Ч KHjPCX* (pH 6.3) в смеси формамид/Н20 (60:40 по
объему), градиент от 0 до 75% Б, 40 мин; объемная скорость: 2 мл/мии.
температура: 45 °С; обнаружение: при 280 им.
дает обычно примерно 15 пиков. Большинство из них соответствуют
индивидуальным олигонуклеотидам, но некоторые - двум или более
компонентам. Для идентификации олигонуклеотидов, элюируемых одновременно,
ВЭЖХ соединяли со скоростным УФ-детектором с перестраиваемой длиной
волны, что позволило проводить идентификацию не только по времени
удерживания, но и по УФ-спектрам разделяемых веществ. Этим методом
удалось установить последовательность различных олигонуклеотидов,
полученных в результате полного или частичного гидролиза РНКазой 5S-TPHK.
печени форели. Метод, основанный на применении ВЭЖХ, более продолжителен
и требует большего количества препарата РНК, чем при использовании гель-
электрофореза изотопномеченой РНК. Тем не менее по сравнению с
традиционными хроматографическими методами он требует в 20 раз меньше
времени и материала, а также позволяет идентифицировать модифицированные
нуклеотиды по их УФ-спектру (последнее невозможно для электрофоретических
методов). Хроматографический метод целесообразно использовать в тех
лабораториях, где не поставлены радиоизотопные методы.
9.5. Применение хроматографии в полинуклеотидном синтезе
ВЭЖХ позволяет быстро и эффективно разделять синтетические
олигонуклеотиды, являющиеся промежуточными соединениями в ступенчатом или
блок-синтезе полинуклеотидов. ВЭЖХ в препаративном варианте значительно
сокращает время синтеза
31*
Рис. 9.14. Разделение смесн
олигодезоксирибонуклеотидов, содержащей синтетический декамер д(С-С-G-А-
Т-А- -Т-С-G-G) [116].
Колонка: 250X4,6 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: зорбакс-NH2;
элюент: растворитель А -
10 мМ КН2РО4 (pH 4,5), растворитель Б -900 мМ КН2РО, (pH 4,1 градиент от
0 до 50% растворителя Б, 50 мин; объемная скорость: 2 мл/мин;
температура: 60 °С; обнаружение: при 280 нм.
t, МИН
Рис. 9.15. Разделение смеси олигодезоксирибонуклеотидов, содержащей
синтетический декамер д(С-С-G-А-Т-А- -Т-С-G-G) [116].
Колонка: 250 X 4,6 мм (йнутр. диаметр); неподвижная фаза: зор-
бакс-ODS, элюент: растворитель А - 10 мМ триэтиламмонийацетат (pH 7,0),
растворитель Б - 60% ацето-иитрила в 10 мМ триэтиламмоний ацетате (pH
7,0), градиент от 0 до 30% Б, 60 мин; объемная скорость;
2 мл/мин; температура: 45 °С; обнаружение: при 280 нм.
t,MMH
Азотистые основания, нуклеозиды и нуклеотиды 485
фрагментов ДНК или РНК. Для проведения синтеза олигодез-
оксирибонуклеотидов требуется получить полностью защищенные фрагменты, а
затем снять защиту с аминогрупп нуклеоос-нований, интернуклеотидных
фосфатов и терминальных гидро-ксигрупп. После снятия защиты олигомеры
обычно очищают методом ВЭЖХ на ионообменных и (или) обращенно-фазовых
колонках (рис. 9.13, 9.14 и 9.15). В работах [95-114] проведены обширные
исследования влияния различных пуриновых и пиримидиновых оснований,
