Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
что некоторые фосфолипиды, например глюкозоаминофосфати-дилглицерид,
также содержат сахарные остатки и что разделить их при помощи ВЭЖХ пока
не удалось. Сфингозиновые производные гликолипидов подразделяются на
церамиды и ганглио-зиды (определение дано ниже), и те и другие входят в
состав животных тканей. Церамиды обнаружены также в высших растениях и
некоторых (очень немногих) микроорганизмах. Глицериды - это основные
компоненты растительных тканей и микроорганизмов, а в животных тканях они
содержатся лишь в небольших количествах. При разделении и индентификации
гликолипидов перед исследователем встают те же проблемы, что и при
разделении фосфолипидов. Поэтому гликолипиды чаще всего хроматографируют
в виде бензоильных производных, которые характеризуются заметным
поглощением при 230 нм.
7.5.2.1. Церамиды и ганглиозиды. Многие авторы дают соединениям
этого класса свои собственные названия, что приводит к путанице, поэтому
кратко остановимся вначале на классификации этих соединений.
N-Ацилсфингозин, называемый церамидом, представляет собой "каркас"
гликозилцерамидов, которые могут содержать один или более различных
сахарных остатков. Галактозилцера-мид (Cer-gal) первоначально назывался
цереброзидом. Прежнее тривиальное название дигликозилцерамидов (Cer-glc-
gal, Cer-gal-gal)-цитозид. Тетрагликозилцерамид (Cer-glc-gal-gal-N-acyl
galactosamin) назывался глобозид. В литературе по
Липиды 41S
ВЭЖХ многие авторы классифицируют церамиды в соответствии с наличием
входящих в их состав жирных кислот гидрокси-групп (HFA-Cer или NFA-Cer).
Ганглиозиды содержат одну или более молекул сиаловой (N-
ацетилнейраминовой) кислоты, связанных с церамидными сахарными остатками.
Наибольшее распространение в ВЭЖХ получила номенклатура, предложенная
Свеннерхольмом (см. подпись к рис. 7.25).
Получение производных и их количественное обнаружение. Авторы работ
[108, 109] изучили методы получения производных некоторых гликолипидов и
рекомендовали в качестве стандартного следующий способ. Высушенные
гликолипиды обрабатывают бензоилхлоридом (10°/о-ный раствор в пиридине,
меньшая концентрация приводит к снижению выхода) при 60°С. Для получения
с количественным выходом NFA-Cer достаточно 30 мин, а для получения HFA-
Cer - всего 15 мин. Полученные производные экстрагируют гексаном, после
чего их необходимо несколько раз промыть 95%-ным метанолом. Следует
отметить, что при такой обработке наряду с О-ацилированием происходит и
N-амидацилироваиие. Обработка гликолипидов бензойным ангидридом
завершается селективным О-ацилированием, однако ее необходимо проводить
при 110°С в течение 16 ч. При такой температуре цереброзиды могут
вступать в побочные реакции, поэтому смесь гликозилцереброзидов
рекомендуют выдерживать в течение 16 ч при 37°С с бензоилхлоридом [110].
Обнаружение бензоилированных липидов проводят при помощи УФ-детектора
(230 нм) и устанавливают их концентрацию по градуировочной кривой,
полученной с использованием стандартных проб бензоилированных Cer-glc или
Сег-lac. При 100%-ном бензоилировании число бензоильных групп в первом
соединении должно равняться шести, во втором - девяти, а в Cer-gal-lac -
двенадцати. Коэффициенты поглощения других гликозилцера-мидов можно
оценить, исходя из предположения об аддитивности поглощения, т. е.
поглощение возрастает с увеличением числа бензоильных групп, и принимая,
что О- и N-бензоильные группы имеют одинаковые коэффициенты поглощения.
Выход после получения производных и разделения при помощи ВЭЖХ составляет
77-90% (по данным, полученным с использованием меченных 14С церамидов).
Предел обнаружения равен 70 пмоль. Авторы работы [111] разделили 6
гликозилцерамидов в виде О-ацетил-Ы-п-нитробензоильных производных с
выходом 75% (рис. 7.23). Как выяснилось, выход гликозилцерамидов из
эритроцитов человека в значительной степени зависит от метода получения
их производных, что свидетельствует о настоятельной необходимости
совершенствования этих методов.
Условия разделения. HFA-Cer можно отделить от NFA-Cer на колонке с
зипаксом (50 см) элюированием 7%-ным этила-
416 Глава 7
1 ! I 1 -I- I
0 10 20 30 40 50 60 70 80
+, мин
Рис. 7.23. Разделение О-ацетнл-Ы-нитро-бензонлглнколипндов fill].
Неподвижная фаза: зорбакс SIL; элюент: гек-сан/двхлорэтаи (2 : 1)+1%
изопропанола, градиентное элюирование от 1 до 5% нзопропаио-ла, 5 мии;
объемная скорость: 0,5 мл/мин; обнаружение: при 254 нм.
/ - глюкозилцерамид; 2 - лактозилцерамид; 3 - лактотриаозилцерамид; 4 -
глоботриаозил-церамид; 5-неолактотетраозилцерамид; б-
глоботетраознлцерамид.
цетатом в гексане, а последующее разделение NFA-Cer-glc и NFA-Cer-gal
можно провести на колонке, заполненной микро-паком-ЫН2-10, используя в
