Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
: 10)
Свободные жирные кислоты, Бондапак FFAP ТГФ,
ацетонитрил/Н20 Из природных жиров 76
Ап
Лихросорб RP-8 (10 мкм) ТГФ,
ацетонитрил/Н20/ Образцы маргарина 146
/СНзСООН
896 Глава 7
транс
6
¦5
<
ЦИС
ю
Рис. 7.7. Разделение метиловых эфиров жирных кислот [48].
' | ' ' ' | | ¦ ' < | | ' t ' ' | | ' ' |
Колонка; 24 см: неподвижная фаза: сферосорб S5W, пропитанный 30%-ный
AgNOj; элюент: 1% ТГФ в гексане; объемная скорость: 2.2 мл/мин; о'ужение:
рефрактометрическое
при 205 нм. ры на рисунке указывают на
положение двойной связи в цепи, например 9=С 18 : 9.
глицериды и обнаружили линейную зависимость между числом атомов углерода
и логарифмом объема удерживания.
В работе [45] описано разделение диэфиров жирных кислот (типа
диметилгидантоиновых диэфиров) на обращенной фазе Се; обнаружение
осуществлялось рефрактометрическим детектором (рис. 7.6а). Как
выяснилось, между log/г и числом атомов углерода в эфирах различного типа
наблюдается линейная зависимость (рис. 7.66).
Разделение эфиров ненасыщенных жирных кислот, в частности
метилстеарата, метилолеата, метилэлаидата и ряда других цис- и гра"с-
изомеров, было проведено на колонках, пропитанных солью серебра [46-48].
На рис. 7.7 показана хроматограмма цис- и транс-изомеров, входящих в
состав маргарина, полученных при разделении на сферисорбе S5W,
пропитанном
УФ-детектор недостаточно чувствителен по отношению к не-
модифицированным жирным кислотам (исключение составляют лишь кислоты с
высокой степенью ненасыщенности), рефрактометрический детектор также не
обеспечивает необходимую (на нанограммовом уровне) чувствительность [42,
43, 49, 50]. Однако некоторые производные жирных кислот способны сильно
поглощать в УФ-области. К их числу относятся прежде всего фенациловые
эфиры и их бром-, хлор- и метоксипроизводные, n-нитробензиловые эфиры, 2-
нафтилациловые эфиры, бензило-
AgN03 (30%).
Липиды 397
Рис. 7.8. Разделение фенилациловых эфиров жирных кислот [55].
Колонка: 90 см; неподвижная фаза: Ji-бондапак Cis; элюент:
ацетоннтрил/Н20, ступенчатое градиентное элюирование (верхняя кривая);
объемная скорость: 2 мл/мнн; обнаружение: по поглощению прн 254 нм.
/-(12:0); 3-(14:0); 9- (15:0); /2 - (16:0); /7-(17:0); /$-(18:0); - (20 :
0);
б - (20 : 4); // - (20 : 3); /5- (20 : 2); /Р - (20 : 1).
вые и некоторые другие производные, используемые для прове-дения
флуоресцентного анализа. Авторы работы [51] проводили обнаружения кислот
Ci6 и Cis в виде бензиловых эфиров, предел обнаружения которых составлял
1-2 мкг. Согласно данным работы [52], предел обнаружения 2-нафтилациловых
эфиров равен всего 4 нг. Некоторые авторы использовали для обнаружения
жирных кислот их rt-нитробензиловые эфиры [53, 54]. Однако большинство
исследователей проводили разделение жирных кислот в виде фепациловых
эфиров. Борг [55] разделил 24 фенилациловых эфира ряда Ci2-С24,
коэффициент поглощения которых достигал 1,4-104 см2/моль (рис. 7.8).
Нижний предел обнаружения этих эфиров составил 10 нг. Между площадью
пиков и концентрацией кислот в пределах 100 нг-100 мкг наблюдались
линейная зависимость. Разделение проводилось на бондапаке Cis (длина
колонки 90 см) при градиентном (ступенчатом) элюировании смесью
ацетонитрил/вода. В раствор фенацилбромида, используемый для получения
производных, обычно добавлялся N, N-диизоприпиламин (катализатор).
Другой интересный метод модифицирования жирных кислот основан на
использовании в качестве ацилирующего агента
398 Глава 7
n-дибромадетофенона и краун-эфиров (например, 1, 4, 7, 10, 13, 16-
гексаоксациклооктадекана) в качестве катализаторов [56, 57]. В ряде работ
описано разделение замещенных фенациловых эфиров [58, 59], и, согласно
данным работы [60], предел обнаружения бромфенилациловых эфиров
капроновой и арахндоно-вой кнслот составляет 2 и 10 пг
соответственно.Разделение эфиров жирных кислот Сз-С24 эти авторы
проводили на двух или трех последовательно соединенных колонках,
заполненных обращенной фазой Сig или фазой для распределения жирных
кислот (FFA). Методы получения и применения привитых (Сз0) фаз на основе
силикагеля описаны в работе [61]. На такой колонке оказалось возможным
разделить "критические пары", папример а- и ^-линолиевые кислоты и
С10/С14 : 1 жирные кислоты, которые не разделяются на колонках с
нормальной фазой (рис. 7.9).
Гидроксикислоты жирного ряда тоже необходимо переводить в
фенилациловые эфиры [62]. На рис. 7.10 показана хроматограмма
метоксифенилациловых эфиров а- и p-гидроксикислот, разделенных на двух
колонках с бондапаком Ci8 при градиентном элюировании смесью
