Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
клеток, где они играют не только структурную роль, но и выполняют
биохимические функции (например, в фотосинтезирующих мембранах-тилакоидах
хлоропластов). В большинстве мембран липиды выполняют барьерную функцию и
участвуют в контроле трансмембранного транспорта различных соединений.
Липиды могут запасаться в клетках растений и животных и служить
источником энергии. Резервные липиды, содержащиеся в семенах растений или
тканях животных, используются для получения масел и, следовательно,
представляют собой источник пищи. Именно поэтому липиды интересуют
исследователей, работающих в фундаментальных и прикладных областях
биохимии, биотехнологии и технологии пищевой промышленности. В целях
изучения состава и свойств липидов разрабатываются новые методы их
разделения и идентификации, к числу которых относится и ВЭЖХ.
Липиды существенно различаются по полярности, что затрудняет выбор
неподвижной фазы и элюента для их разделения. Например, разделение
искусственной смеси глицеридов, фосфолипидов, холестерина, цереброзидов и
ряда других
.384
Глава 7
липидов на колонке длиной 1 м при градиентном элюировании тремя
растворителями длится 3 ч [2]. Разделить же смесь липидов, полученную
экстракцией из природных объектов, на индивидуальные липиды каждого
класса за один хроматографический цикл, по-видимому, невозможно. Поэтому
чаще всего хроматографический анализ биологических образцов сводился к
групповому разделению липидов различных классов. Авторы работы [3]
осуществили разделение природной смеси липидов, содержащей углеводороды,
холестерины, воски и глицериды (время разделения составило 30 мин). В
работе [4] предложен метод разделения экстрактов растительных липидов на
липиды разных классов (каротиноиды, хлорофиллы, липофильные хи-ноны),
ставший в настоящее время рутинным. В большинстве случаев, однако,
необходима предварительная обработка экстрактов липидов. Обзор методик
экстракции, очистки и предварительного фракционирования природных липидов
опубликован Жуковым и Верещагиным [1].
Таблица 7.1. Химическая структура ряда важных методов
КарОТИНСИДЫ ^ Фосфо-и гликолипиды
jx..-v-k, Ch,ocor'
("./и^жирны* кислоты)
,но^ '-Лютеин CHjOCOR1 r'ococh о
I | и "
CHjO-P-OCHjCHjNICHjI,
Ю1е
''г: каротин
фосфа гид ия кояин (лецитин)(Рх)
он <">
•он
ch2ocor
СН?0Н
Дигалак тзилдиглицерид (д ГДГ)
Првнилхиноны
о
о
A/WWV\/VV\
Липиды 365
Продолжение
о
Аллллуу^ yv'
Ганглиозид (гм 1)
Терленоидные растительные гормоны
ГК2ь гк29 АК
ГК-гиБверелловая кислота и ее производные
АК-авсцизовая кислота
Обнаружение липидов при разделении их по методу ВЭЖХ, как правило,
осуществляется по поглощению в УФ-области спектра или рефрактометрически.
Большинство мембранных, барьерных и поверхностных липидов имеют полосу
поглощения с УФ-области, однако молярный коэффициент экстринкции
насыщенных и моноеновых липидов относительно мал. Высокий коэффициент
экстинкции имеют лишь липиды с большим содержанием ненасыщенных
углеродных связей. Рефрактометрический метод недостаточно чувствителен, и
его можно применять только при изократическом элюировании. Иногда для
обнаружения липидов используется пламенно-ионизационный детектор с
подвижной проволокой (этот метод рассмотрен Айтзетмюлле-ром [149]),
однако элюент и липиды должны при этом значительно различаться по
летучести. Необходимость сжигания разделяемых соединений делает
невозможным их дальнейшее изучение. Чувствительность этого метода
обнаружения пример-
25-1489
386 Глава 7
но такая же, как рефрактометрического. В литературе описаны примеры
применения и других детекторов, в том числе ИК, сцинтилляционного,
флуоресцентного и электронозахватного [24, 131, 142, 143, 149], но
применяются они в основном для решения специфических проблем.
В соответствии с тем что наибольшее распространение получил
фотометрический метод обнаружения, рассмотрим прежде всего липиды,
обладающие способностью к поглощению в видимой и ближней УФ-области (до
250 нм). Липиды, которые поглощают в области длин волн меньше 250 нм,
будут рассмотрены во втором разделе.
7.2. Пигменты и пренилхиноны
К этой группе липидов относятся все липофильные пигменты, относительно
хорошо поглощающие в видимой и ближней ультрафиолетовой областях спектра.
Все они содержат или системы сопряженных двойных связей (каротиноиды,
производные витамина А), или хромофорный порфирин с терпеноидными
спиртами в боковой цепи (хлорофиллы), или имеют хиноновые структуры с
открыто цепочечными терпеноидными спиртами (пренолы или пренилхиноны -
пластохиноны, убихиноны, токоферолы, витамин К).
Пигменты и пренилхиноны играют важную роль в биохимических процессах,
