Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Хол - холестерин; СфМ - сфингомиелин.
412 Глава 7
¦з
Рис. 7.21. Разделение предварительно очищен-
ного коммерческого пре-пар ата "молекуляриых
с:
видов" лецитина яичного желтка [104].
Неподвижная фаза: д-бон-
дапак С[8; элюент: СН3ОН/ /HjO/хлороформ (100 : 10 : 1); детектор:
рефрактометриче-
ский.
¦"Г|
14:0,14:0 160.16:0 16:0,18:0 18 0,18:0
?i+?2 - окисленные продукты с "эффективным углеродным числом" около 29;
Ез - 1-16 : 0-2-18 : 2; ?" -
1-16 : 0-2-18 : I; Еъ - I-I8 : 0-2-18 : 2; Ее~ 1-18 : 0-2-18 : I.
0
20
40
60 V, МЛ
кислот или других ионных модификаторов [79, 102]. Пример оптимизации
условий разделения смеси природных фосфолипидов, полученных экстракцией
из мозга и печени крысы, приведен на рис. 7.20. По-видимому, разделение
всех "молекулярных видов" фосфолипидов в рамках одного
хроматографического цикла невозможно. Авторы работы [103] попытались
разделить по "молекулярным видам" фосфолипиды яичного желтка на восьми
последовательно расположенных колонках длиной 1 м каждая, заполненных
биосилом НА. Однако добиться полного разделения смеси на "молекулярные
виды" им не удалось. Следует тем не менее отметить, что смесь
синтетических препаратов фосфатидилхолина была разделена на двух
соединенных вместе колонках, заполненных соответственно бондапаком С is и
неподвижной фазой на основе жирной кислоты (Fatty Acid-column фирмы
Waters). Элюирование осуществлялось в изократическом режиме смесью
метанола, воды н хлороформа [104]. Время удерживания увеличивалось в
соответствии с "эффективным углеродным числом", которое по определению
авторов работы [104] представляет собой разность между числом ацильных
атомов углерода и двойных связей. Пример разделения лицитинов яичного
желтка приведен на рис. 7.21.
Надежное обнаружение фосфолипидов при помощи рефрактометрического
детектора возможно лишь при их концентрации выше 500 нмоль/л. Авторы
работы [105] проводили обнаружение фосфатидилхолинов по поглощению в УФ-
области (при 203 нм) после их разделения на обращенной фазе нуклеосил-5-
С-18 при элюировании смесью метанол/фосфатный буфер, pH 7,4 (9,5 : 0,5).
Определение жирнокислотного состава собранных
Липиды 41И
Рис. 7.22. Разделение "молекулярных видов" фосфатидилхолинов (а) и фос-
фатидилэтаноламииов (б) из печени крысы [106].
Неподвижная фаза: ультрасфер ODS; элюеит: СНзОН/НгО/ацетоиитрил
(90,5:7:2,5) + 4-20 ммоль/л холинхлорида; объемная скорость: 2,0 мл/мин;
обнаружение: при 205 нм.
/ - (14:0/22:6); 2 - (18 : 2/18 : 3+14 : 0/20 : 4); 3 - (16 : 1/18 :
2); 4-( 18:2/22:6+
+ 15:0/22:6)- 5 - (16 : 0/20 : 5+18 : 2/20 : 4); 6- (18:2/18:2); 7 -
(16 :0/16 : 1): 8 -
(16 : 1/18 : 1); 9 - (16 : 0/22 : 6); 10 - (16:0/20:4); // - (16 : 0/18 :
2); 12 - (18 : 1/18 : 2);
13- (16 : 0/22 : 5п-3); 14 - (16 : 0/22 : 5п-6+18 : 0/20 : 5); 15 - (16 :
0/20 : Зп-6); 16 -
(17:0/18:2 + 16:0/20:Зп-9); 17 - (16 : 0/18 : 1); 18 - (18 : 1/18 : 1);
19 - (18 : 0/22 : 6); 20 - (18:0/20:4); 21 - (18 : 0/18 : 2); 22 - (18
: 0/17 : 1 + 17 : 0/18 : 1); 23 - (18 : 0/22 : 5п-3);
24 - (18 : 0/22 : 5п-6); 25 - (18 : 0/20 : Зп-6); 26 - (18 : 0/18 : 1);
27 - (20 : 0/22 : 6); 28 -
(20 : 0/20 : 4).
фракций показало, что между log^R и числом атомов углерода существует
линейная зависимость. Кроме того, как выяснилось, существует также
взаимосвязь между "гидрофобным углеродным числом" (ГУЧ)--суммарным числом
атомов углерода и двойных связей и временем удерживания. Так, например,
время удерживания ФХ-ди-18:1 отличается от такового для ФХ-18 : 0/18 : 2,
поскольку ГУЧ этих соединений различно. Пример разделения "молекулярных
видов" ряда природных фосфолипидов приведен на рис. 7.22 [106].
414 Глава 7
Разделение проводилось последовательно на колонках с ли-хросорбом SI-
100 и ультрасфером ODS, на последней колонке в соответствии с
"молекулярным видом" соединений. Двадцать два из двадцати восьми
идентифицированных пиков соответствуют индивидуальным "молекулярным
видам", а шесть - смеси двух "молекулярных видов".
Применение неподвижных фаз, пропитанных нитратом серебра, которые в
настоящее время выпускает ряд фирм, вероятно, позволит добиться более
полного разделения "молекулярных видов". В работе [107] описано
разделение сфингомиелина и цереброзида на колонках с обращенной
неподвижной фазой и неподвижной фазой, пропитанной нитратом серебра (см.
рис. 7.24).
7.5.2. Гликолипиды
Гликолипиды делятся на два класса: к первому относятся гликолипиды, в
состав которых входит остаток сфингозина, ко второму- имеющие в своем
составе остаток глицерина. В состав гликолипидов входят также остатки
жирных кислот и сахаров. Липополисахариды бактерий по определению не
относятся к гликолипидам, поскольку растворимы в воде. Следует заметить,
