Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пропанол/этилацетат/бензол/НгО дает хорошие результаты при разделении ФГ,
ФЭ, ФИ, ФС, ФХ лизоФХ и сфин-гомиелина [ 151]. Обнаружение меченных 32Р
липидов осуществляют при помощи проточного детектора по радиоактивности в
комбинации с доступным жидкостным сцинтилляционным счетчиком. Обе системы
могут работать согласованно.
7.5.1.2. Немодифицированные фосфолипиды. Немодифициро-панные липиды
большинство исследователей обнаруживают по поглощению в УФ-области в
интервале 203-213 нм. Многие органические растворители сильно поглощают в
этой области, поэтому чаще всего применяются смеси
ацетонитрил/метанол/вода илн гексан/изопропанол/вода. Фосфатидилхолин
(ФХ) и сфингомиелин были несколько лет назад разделены на колонке
Липнды 409
Рнс. 7.17. Разделение фосфолипид-иого экстракта из меченных 32Р
дрожжевых клеток [91].
Неподвижная фаза: лихросорб SI-60
(10 мкм); элюент: хлороформ/пропа-
иол/уксусная кислота/Н20 градиентное элюирование от 50 : 55 : 2,5 : 5
до, 50 : 55 ; 2,5 : 8,75 и затем до 50 : 55 : 5 : 10, объемная скорость:
0,6 мл/мин.
/ - ФА; 2 - RФГ; 3 - ФЭ; 4 - ФГ; 5 - ФС; 7 - ФИ; 8 - ФХ; 10- ДФИ; //-
неидентнфицирозаи.
с микропаком SI-10 [92], их коэффициенты поглощения при 203 нм лежат в
интервале от 200 см2/моль (насыщенный ФХ-18:0) до 3,46-104 см2/моль
(высоконенасыщенный ФХ-20:4). Авторы работы [93] разделили смеси,
содержащие практически все основные фосфолипиды, включая ФИ, ФС, ФЭ, ФХ и
сфингомиелин. Элюирование проводили также смесью ацетонитрил/метанол/вода
(130:5: 1,5), но заменили 85% воды на фосфорную кислоту, что значительно
повысило селективность разделения (рис. 7.18).
К сожалению, фосфорная кислота разрушает плазмалогены, а также
затрудняет обнаружение фосфатов. Авторы работы [94, 95] расширили список
выделенных фосфолипидов. На колонке с лихросорбом SI-60 при градиентном
элюировании смесью гексан/изопропанол/вода (6:8: 1,4->-6 : 8 : 0,75) они
разделили ФК, ФХ, ФЭ, ФИ, ФС, ЛФХ, ЛФЭ, сфингомиелин и холестерин.
Обнаружение осуществлялось при 206 нм. Коэффициенты поглощения при этой
длине волны лежат в пределах от 600 см2/моль (ФХ-16:0) до 1100 см2/моль
(ФХ-18: 1). Следует отметить, что ТГФ или диоксан образуют пероксиды,
поэтому их нельзя применять для элюирования. На колонке с бондапаком-ЫНг
было проведено количественное разделение ФГ, ФК, ФС, ФХ и триглицеридов.
Для обнаружения был использован пламенноионизационный детектор с
подвижной проволокой. Диапазон линейности величины сигнала детектора
соответствует 50-• 250 мкг обнаруживаемых соединений. Для разделения
смеси ряда фосфолипидов, холестерина, цереброзида и некоторых
"молекулярных видов" соединений этой группы, как показано в работе [96],
пригодна также колонка с ультрасилом NH2.
410 Глава 7
Рис. 7.18. Разделение фосфолипидных стандартов [93].
Неподвижная фаза: микропак SI-I0 (Ю мкм); элюент:
ацетонитрил/метаиол/НзРО* (85'\) (130: 5: 1,5): объемная скорость; 1
мл/мин; обнаружение: при 203 нм.
1 - СФ; 2 - ФИ; 3 - ФС; 4 - ФЭ; 5 - фосфатидилмоиометилэтаиоламин; 6 -
фосфатидил-диметилэтаноламии; 7 -ЛФЭ; 8 - ФК, ФГ; 9 - ФХ; /0 - J1PC: // -
ЛРХ; 12 - сфинго-миелин.
Элюирование велось смесями гексан/изопропанол (5,5 : 8) и
гексан/изопропанол/метанол/вода (5,5:8: 1 : 1,5) в ступенчатом
градиентном режиме. Фосфолипиды пшеницы (колонка с пора-силом) элюировали
смесью гексана и изопропанола (6:8 по объему) при линейном увеличении
содержания воды от 0,5 до 1,5% [97]. Обнаружение фосфатов проводилось по
Бартлету [98] или по Фиске-Суббароу [99] при длине волны 206 нм. Сигнал
детектора может быть с помощью этих методов отградуирован, однако при
обнаружении приходится предполагать, что определяемый пик соответствует
липиду с одним и тем же жирнокислотным остатком [100].
Авторы работы [101] провели количественное сравнение градуировки при
разделении фосфолипидов при помощи ВЭЖХ и ТСХ и показали хорошее
совпадение диапазона линейности градуировочной кривой в интервале от 2,5
до 20 мкг. Для лучшего разделения ФХ и сфингомиелина они рекомендовали
поместить перед колонкой с лихросорбом диолом 3-см колонку с SI-60 (рис.
7.19).
Обычно селективность увеличивают в результате соответствующего подбора
состава элюента и путем добавления в него
Рис. 7.19. Разделение фосфолипидов из амниотической жидкости [101].
Предколонка: 3 см, заполненная SI-60 (10 мкм); неподвижная фаза в
основной колонке: лихросорб диол
(10 мкм); элюент: ацетоннт-рил/вода (80 : 20) и ацето-нитрил (Б).
градиентное элюирование от 87,5 до 22% Б; обнаружение; при 203 ни*
г, мин------>
Рис. 7.20. Разделение экстрактов липидов из печени (а) и мозга крысы (б)
[102].
Предколонка; 4 см, заполненная видаком; неподвижная фаза в основной
колонке: мик-ропак SI-5; элюеит: гексан/изопропанол/НаО/Н^БС^ (А - 97 : 3
: 0 : 0.02 и Б - 75 : 24 : 0,9:0). градиентное элюиройанне до 100% Б;
объемная скорость: 1,5 мл/мнн; обнаружение: при 205 нм.
