Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
экстракта растительных липидов. Обнаружение галактолипидов проводили
рефрактометрически, а обнару- ш жение пигментов, осу- ? ществляемое
парал- I лельно, - спектрофо- о тометром при 430 нм, с сигнал с которого
выводился на второй самописец. Обнаружение пигментов можно вести и при
208 нм ввиду высокого содержания в них ди- и триеновых жирнокислотных
остатков (линолевой и лино-леновой кислот). Как
Рис. 7.27. Разделение экстракта липидов из зеленых i листьев салата
[11]. S
Колонка: 5 см; неподвижная о
фаза: лихросорб RP-2 (5 мкм); ^ Элюент: ацетонитрил/Н,0 (19 : 1) о с
добавлением 0,01 М фосфатно- с го буфера до pH 7,7: объемная скорость:
2.0 мл/мнн; температура колонки: 40 °С: обнаружение:
При 430 (а). 224 (о) и 204 нм (в).
2, 3 - каротинонды: 4, 5 - хлорофиллы; 7 - ФИ+ФГ: 8 - Ф":
9 - ФХ-дн-18-0; // -МГДТ; 12,
/з-дгдт.
27*
420 Глава 7
показали авторы работы [11], изучавшие разделение растительных тканей,
содержащих и не содержащих хлорофилл, кароти-ноиды и хлорофиллы ке мешают
обнаружению гликозилглице-ридов. При высоком содержании пигментов
целесообразно использовать рефрактометрический детектор, поскольку
коэффициент преломления пигментов невелик. Однако чувствительность
рефрактометрического обнаружения галактолипидов примерно в четыре раза
меньше, чем при обнаружении УФ-дектектором (при 208 нм). Диапазон
линейности сигнала УФ-детектора соответствует 0,2-200 мкг галактолипидов
в анализируемой пробе. Чувствительность обнаружения (при 206 нм)
повышается при замене в элюентной смеси метанола на ацетонитрил.
Результаты количественного анализа липидов при помощи ТСХ и ВЭЖХ хорошо
согласуются. Рис. 7.27 позволяет сравнить эффективность обнаружения
растительных липидов при длинах волн 430, 224 и 204 нм после их
разделения на колонке с обращенной фазой RP-2 (50X4,6 мм внутр. диаметр,
5 мкм).
7.6. Углеводороды, спирты, воски, производные терпеноидов
Природные воски состоят из спиртов, углеводородов и сложных эфиров. Эти
соединения обычно входят в состав кутикулы растений и животных и
участвуют в удерживании в организме воды. Воски также служат защитным
барьером против внешних воздействий. Состав восков может быть самым
разным и, по-видимому, зависит от того, какую функцию выполняет та или
иная поверхность. Например, содержание углеводородов в вос-ках насекомых
составляет около 50%, тогда как в животных восках обычно не достигает и
1%. Углеводороды - основные компоненты нефти и природного газа -
разделяют на олефины, парафины и многие другие компоненты. Анализ этих
соединений главным образом проводят при помощи ГХ, ВЭЖХ не получила
широкого распространения.
В данном разделе мы рассмотрим разделение при помощи ВЭЖХ некоторых
фитогормонов, синтезированных по терпено-идному пути, и ряда эфирных
масел.
7.6.1. Углеводороды и липофильные спирты
Фракционирование углеводородов, альдегидов, кетонов и три-терпенов для
последующего газохроматографического разделения осуществляют на 1,4-
метровой колонке с силикагелем при элюировании смесью гексан/этилацетат
[116]. В разд. 7.4 уже отмечалось, что углеводороды отделяют от
глицеридов на колонке с неподвижной фазой SI-60 [3]. На этой же колонке
было
Липиды 421
проведено разделение технических олефинов при элюировании изооктаном и
обнаружении при помощи рефрактометрического детектора [117-119]. Для
разделения сложных смесей многоядерных ароматических углеводородов широко
применяют колонки с обращенными фазами, например зорбаксом ODS и
лихросорбом RP-18 [120], а также видаком 201 ТР [121]. Лучший элюент -
это смесь ацетонитрил/вода. Время удерживания увеличивается с увеличением
отношения длины молекулы к ее ширине. Для обнаружения пригодны
рефрактометрический, УФ-и флуоресцентный детекторы [122]. Жирные спирты с
длинной углеводородной цепью (С49-Css) разделяют в виде их динитро-
бензоиловых эфиров [123]. Предварительное отделение насыщенных спиртов от
ненасыщенных проводят с помощью ТСХ на неподвижных фазах, содержащих ионы
серебра. После этого насыщенные спирты разделяют на колонке с радиалпаком
С-18 (10 см), а ненасыщенные - на колонке с микропаком МСНС-18 (30 см)
при элюировании смесью диоксан/ацетонитрил (3:2 и 3:13 соответственно).
7.6.2. Воски, эфирные масла, терпеноидные растительные гормоны
Воски - это сложные эфиры спиртов с длинной углеродной цепью (10-30
атомов углерода) и длинноцепочечных жирных кислот. Они образуют покрытие
поверхности многих организмов и подробно описаны в литературе [124, 125].
Данные по разделению этих соединений при помощи ВЭЖХ крайне ограниченны,
что, по-видимому, объясняется чрезвычайной сложностью их идентификации,
обусловленной отсутствием соответствующих стандартов. Идентификацию, как
правило, осуществляют физическими методами, например методом масс-
спектрометрии. Содержащиеся в масле хохобы (Apache Jojoba) эфиры были
разделены в соответствии с длиной их углеводородной цепи на двух
последовательно соединенных колонках (длиной по 30 см каждая),
