Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
качестве элюента 1,2%-ный раствор пропанола в циклобутане [109]. Если
вместо этилацетата применяют диоксан, обнаружение осуществляют при 230
им, что в 14 раз увеличивает чувствительность по сравнению с обнаружением
при 280 нм. Градиентное элюирование вызывает сильный дрейф нулевой линии,
и чтобы избежать его, авторы работы [112] рекомендуют создавать в ячейке
сравнения такой же градиент, как и в рабочей. В этом случае разделение и
обнаружение липидов разных классов можно осуществлять без предварительной
очистки пробы; достигаемый предел обнаружения равен 10 пмоль. В работе
[113] предложен другой, более удачный вариант анализа Cer-glc, Cer-lac,
три- и тетрагликозил-Сег (глобозидов) и N-ацетилсфингозина. Авторы этой
работы проводили разделение на колонке с зипаксом при градиентном
элюировании смесью диоксаиа (1-20%, линейный градиент) и гексана. Предел
обнаружения Cer-glc и тетраглобозида составил соответственно 2 и 20
пмоль. Нитробензоилпроизводные можно разделять на колонке с зорбаксом SIL
при градиентном элюировании 1->-5% изопропанолом в смеси
гексан/дихлорэтан (2: 1). Обнаружение осуществлялось при 254 нм [111].
Для разделения "молекулярных видов" липидов полезно объединять
колонки, заполненные неподвижной фазой, содержащей ионы серебра, и
обращенной фазой [107]. Насыщенные и моноеновые NFA-Cer можно сначала
разделить на колонке с хромопаком, пропитанным нитратом серебра, элюируя
смесью гексан/изопропанол (9:1), а затем провести разделение полученных
фракций на "молекулярные виды" на нуклеосиле Cie элюированием чистым
метанолом (рис. 7.24). С помощью этого метода были разделены также
немодифицированные HFA-Cer (обнаружение при 203 нм).
Как показали авторы работы [114], для обнаружения немодифицированных
гликозилцерамидов и ганглиозидов целесообразно использовать пламенно-
ионизационный детектор с подвижной проволокой [114]. Разделение эти
авторы проводили на
Липиды 417
Рис. 7.24. Разделение З-О-бензоилироваииых NFA-церамидов из мозга коровы
[107].
а - предварительное разделение NFA-Cer на две основные фракции.
Неподвижная фаза: хромопак, пропитанный раствором серебра; элюент:
гексан/изопропаиол (9: 1); объемная скорость: 0.5 мл/мии; б, в -
хроматограммы фракций, полученных после предварительного разделения.
Неподвижная фаза: иуклеосил-5 С^; элюеит: СНзОН; объемная скорость: 2
мл/мнн; обнаружение: прн 230 нм.
Фракция 1 (б) - насыщенные и моноеновые жирнокнслотные произзодные;
фракция 2 (в) - ненасыщенные жириокислотиые производные с двумя двойными
связями.
колонке с SI-60, оптимальным элюентом для разделения глико-зилцерамидов
оказалась смесь хлороформ/метанол, а для ган-глиозидов - смесь
хлороформ/метанол/водный раствор НС1 (рис. 7.25). Влияние фосфолипидов
можно элиминировать с помощью гидролиза NaOH (гликосфингозины при этом не
гидролизуются) .
7.5.2.2. Гликозилглицериды. Соединения этого класса галак-
тозилглицериды - основные компоненты мембран хлоропластов высших растений
и водорослей, сульфохиновозилдиглицерид (растительный сульфолипид)
обнаружен во всех фотосинтезирующих видах растений, а маннозилдиглицериды
содержатся в значительных количествах в бактериях. В литературе тем не
менее описано сравнительно мало примеров разделения этих
гликозилглицеридов при помощи ВЭЖХ. Галактолипиды вместе с липидами
других классов (разд. 7.4.1 и рис. 7.14) были разделены на колонке с
порасилом II [77], а также на колонке со сферисорбом ODS [115],
обнаружение осуществлялось с помощью рефрактометрического или пламенно-
ионизационного
27-1489
t, мин
Рис. 7.25. Разделение стандартных смесей ганглнознд- (а) и
глнкосфинголнпи-
дов (б) мозга быка [114].
Неподвижная фаза: лихросорб SI-60 (9 мкм); элюент: хлороформ/метанол/0.01
М НС1 (60 : 35 : 4); детектор ПИД с подвижной проволокой.
а: 1, 5, 8 - неидентнфицированы, 2 - Cer-glc-gal-sialo, 3 - Cer-glc-
galsialo-galNAc 4 - Cer-glc-ga!sialo-ga!NAc-gal, 6 - Cer-g!c-ga!s!alo-
ga!NAc-ga!sia!o, 7 - Cer-glc-gal-disialo-galNAc-gal, 9 - Cer-glc-gal-
disialo-galNAc-gal3ialo.
6: / - иеидентнфнцнроваи, 2 - Cer-glc, 3 - Cer-!ac, 4 - Cer-d!-ga!-glc 5
- Cer-elc-eal-galNAc-galN.
МГДГ
---Д n
---430HM
Хла
Хл b Лютеин ft
i !'
I
10 t, мин
20
Рис. 7.26. Разделение экстракта лнпидов из зеленых листьев кукурузы
(Иван-чик, 1980 г., неопубликованные данные).
Неподвижиая фаза: лихросорб RP-8 (5 мкм); элюент: СН30Н/Н20 (9: 1);
объемная скорость: 2 мл/мнн; температура: 40 С; обнаружение:
рефрактометрическое н спсктпофото-метрнческое прн 430 нм (параллельное).
Липиды 419
детектора. В лаборатории авторов данной главы содержащиеся в
растительных экстрактах галактолипиды были непосредственно S разделены на
колонке | с лихросорбом RP-8 ° (обращенная фаза, 25 ° см), элюентом
служила смесь метанол/вода (9:1). Обнаружение проводилось параллельно УФ-
и рефрактометрическим детекторами. На рис. 7.26 приведена хроматограмма
