Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
УФ (200 или 220) 53,6 15
буфер (pH 7,4), Б: 0,1 М перхлорат натрия/
илн флуоресценция
/60%-ный ацетонитрил, линейный градиент от
(флуорескамин)
А до Б (0,75% ацетонитрила/мин)
А: 0,1 М перхлорат натрия+5 мМ фосфатный
УФ (200 или 220) 60,0 15
буфер+0,1 %-ная фосфорная кислота (pH 2,1),
или флуоресценция
(флуорескамин)
Б: 0,1 М перхлорат натрия+0,1 %-ная фосфор
ная кислота/60 %-ный ацетонитрил, линейный
градиент от А до Б (0,75% ацетонитрила/мин)
59
Гель TSK-2000 0,05 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,2)/SDS
7,5X600 УФ (210 или 280) 14,8 объем
(10 мкм) (99,7 : 0,3) (0,3 мл/мин)
элюирова
ния)
Бондапак Ci8 Корасил Метанол/0,1 %-ная фосфорная кислота (2:3)
4X300 УФ (225) 4,6 90
Полигоснл Ci8 Иетанол/вода/трифторуксусная кислота (65 : 35 :
4X300 УФ (205) --- 103
(10 мкм) : 0,1) (1,2 мл/мин)
342 Глава 5
Рис. 5.35. Хроматограмма очищенного бычьего (ThrB30), бычьего,
человеческого и сниного иисули-нов, полученная методом ВЭЖХ [70].
Колонка: 200X4 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: нуклеосил 5 C|g, 5
мкм; элюент; X - 0,005 М тартратный буфер (pH 3,0)+0,005 М 1-
бутансульфонат натрия+ +0,05 М сульфат натрия, Б ~ ацетонитрил
(50%)/0,005 М тартратный буфер (pH 3,0)-f0,l М 1-бутансульфонат
иатрия+0,1 М сульфат натрия (50%), А : Б=41.6 : 5#,4: объемная скорость;
1 мл/мнн; обнаружение; по поглоще" нню прн 220 нм.
t, мин
(pH 2,2, 5:1:4) f86]. Коэффициенты емкости инсулинов возрастают в ряду
изопропанол - тетрагидрофуран - ацетонитрил - метанол, если элюирование
ведется смесью мета-нол/Х (органический растворитель)/0,1 М перхлорат
натрия (табл. 5.25).
Длительное использование обращенно-фазовых колонок, особенно для
разделения пептидов с большим молекулярным весом, приводит к снижению их
эффективности, однако путем силирования обращенно-фазового носителя
хлордиметилоктадет цилсиланом в толуоле можно вновь получить относительно
хорошее разделение [103].
При разделении методом высокоэффективной гель-проникающей
хроматографии на относительно недавно разработанных неподвижных фазах,
содержащих додецилсульфат натрия TSK 2000 SW), пептиды и белки с
молекулярной массой >5000 должны элюироваться в последовательности,
определяемой размером их молекул. Однако пептиды типа инсулина (5782) и
глюкагона (3485) в этой системе разделяются по другому механизму [59].
Таблица 5.25. Коэффициенты емкости бычьего и свниого иисулинов при
элюировании с применением органических растворителей [86]
Колонка: 250X4,6 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: нуклеосил Ю С|8;
элюент: метанол /X/ 0.1 М перхлорат натрия (pH 2,2) (5:1: 4)
Инсулин Изопропанол Тетрагидро Ацетоннтрил Метзнол
фуран
Бычий 0,17 1.01 2,69 4,23
Свиной 0,18 1,95 4,10 9,10
7
Рис. 5.36. Разделение смеси 13 полипептидов методом ВЭЖХ [14].
Колонка: 100X5 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: гиперсил-ODS, 5
мкм; элюент: А - 0.1 М однозамещенный фосфат натрня/фосфорная кислота (pH
2,1). суммарная концентрация фосфата 0,2 -моль'л. 1> - ацетонитрил.
профиль градиента показан на рисунке штричоноЯ линией; объемная скорость:
1.5 мл/мин; обнаружение: по поглощению при 223 нм; проба: от 1 до 1U мкг
каждого полипептида и 530 иг триптофана в качестве внутреннего стандарта
в исходном растворителе.
/ - триптофан: 2 - лизин-вазопреесин; 3 - аргинин-па.юпрсссин: 4 -
окентоции; 5 -
АКТГ:_24; 6 - инсулин А; 7 - бомбезип; ? -вещество Р; 9 -- соматостатин;
10 - инсулин В; //-человеческий кальцнто! ни: 12 - глюкагоп; 13 -
кальиитонин лосося; 14 - мелитнн.
344 Глава 5
Рис. 5.37. Разделение смеси 6 белков методом ВЭЖХ [14],
Условия разделения см. в подписи к рис. 5.36.
1 - триптофан; 2 - нейротоксин 3 кобры; 3 - рибонуклеаза А; 4 - инсулин-
5 -цито-хром с; ? - лнзоцим; 7 - миоглобнн. '
5.3.5. Гормоны другого происхождения
Методы ВЭЖХ, подобные описанным в предыдущих разделах, были использованы
для разделения нейропептидов типа ангиотензинов [6, 15, 43, 52, 72, 90,
107], бомбезина [14, 66], нейро-тензина [14, 15, 66], вещества Р [14, 43,
