Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
в ткани (влажная масса) менее 10 нмоль/г или 0,1-0,5 мкг/л в сыворотке
вполне обычно [11, 12]. Очевидно, что потребность в определении низких
концентраций биогенных аминов в биологических жидкостях, отдельных
участках мозга и популяциях клеток стимулирует разработку соответствующих
аналитических методов. Одинаково большое значение имеют повышение
специфичности хроматографического разделения и совершенствование методов
обнаружения. Постоянное совершенствование аналитических методик часто
приводит к уточнению концентрационных уровней биогенных аминов,
установленных разработанными ранее менее совершенными способами,
поскольку действительные уровни концентрации во многих случаях
оказывались значительно ниже установленных. Пересмотр уровней содержания
р-гидрокси-^-амино-масляной кислоты [13, 14], путресцина [15, 16] и
холина/ацетил-холина [17] в животных тканях служит тому примером.
Ввиду неоднородного распределения и неоднозначных функций биогенных
аминов в центральной нервной системе необходимы такие аналитические
методики, которые позволяли бы анализировать отдельные участки мозга. В
связи с этим помимо хроматографических методик были разработаны методы
анализа, основанные на специфических ферментативных реакциях, часто
предусматривающие использование радиоактивных субстратов, а также
иммунологические методы [18, 19].
Например, для определения катехоламинов [20-28], серотонина [29, 30],
{5-фенилэтиламина [31, 32], гистамина [30-35], холина и ацетилхолина [36,
41] и путресцина [16] разработаны ферментативные методы с использованием
радиоактивной метки (радиоферментативные методы). Усовершенствование этих
методов было проведено главным образом Да Прада и Цюрхе-ром [83].
Определение норадреналина и адреналина (нор- и
Биогенные амины 35Г>
эпинефрина) было осуществлено с чувствительностью и специфичностью,
сравнимыми с получаемыми методом хромато-масс-спектрометрии.
Радиоферментативный метод основан на использовании реакции метилирования
адреналина и норадрена-лина, катализируемой ферментом катехол-О-
метилтрансферазой (СОМТ) в присутствии S-аденозилметионина (3Н-метил), в
результате которой образуются метанефрин и норметанефрин. Определение
проводится ион-парной экстракцией с последующим разделением полученных
метоксиаминов методом ТСХ, их селективным окислением, введением тритиевой
метки и обнаружением методом сцинтилляционой спектрометрии эпинефрина и
норэпинефрина. Эта методика, позволяющая также проводить точное
определение дофамина, была значительно улучшена путем замены ТСХ на ВЭЖХ,
что сделало возможной ее частичную автоматизацию [84, 88].
Важный, шаг вперед в области анализа биогенных аминов был сделан в
последние несколько лет благодаря быстрому совершенствованию колоночной
жидкостной хроматографии и разработке новых методов обнаружения,
пригодных для применения в этом виде хроматографии. Если с появлением
электронозахватных и масс-спектрометрических детекторов газовая
хроматография стала высокочувствительным, селективным и гибким методом,
позволяющим решать различные аналитические задачи [42-55], то к
существенному совершенствованию ВЭЖХ привело применение флуориметрических
и электрохимических детекторов [56-75]. Электрохимические методы
используются в основном для обнаружения катехоламинов, хотя они также
пригодны для обнаружения некоторых индолов.
Следует отметить, что применению электрохимических детекторов в
рутинном анализе препятствует ряд проблем. Так, например, в литературе
прослеживается значительное варьирование пределов обнаружения дофамииа:
от 500 [76], 200 [68], 100 [78], 53 [79], 20 [77] до 15 пг [80]. Эти
причины в известной степени способствовали разработке оптических методов
обнаружения, например флуоресцентных или хемилюминесцент-ных [82].
В литературе описано лишь считанное число примеров одновременного
определения большого числа биогенных аминов и их метаболитов, а также
родственных им соединений в одной пробе. Объясняется это тем, что трудно
подобрать такую методику анализа, которая позволила бы провести
определение всех перечисленных соединений. Очень сложно также подобрать
соответствующие методики предварительной обработки пробы, отделения
необходимого компонента от матрицы и его обнаружения.
23*
356 Глава 6
6.2. Методы подготовки проб
Единой общей методики подготовки проб для выделения биогенных аминов
методом жидкостной хроматографии не существует. Более того, катехоламины
и их производные, а также простые алифатические амины могут частично
теряться из-за их разложения в щелочной среде. Как правило, биогенные
амины определяют в отдельных участках головного мозга, в плазме или
сыворотке крови и моче. Методика подготовки биологических проб к анализу
одинаково зависит как от природы, так и от концентрации анализируемых
соединений. Свободные основания и соли многих алифатических аминов и (5-
фенетиламинов хорошо растворимы в воде, и поэтому применять экстракцию с
