Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
помощью не смешивающихся с водой органических растворителей не
представляется возможным.
6.2.1. Биогенные амины животных тканей и биологических жидкостей
6.2.1.1, Алифатические амины и полиамины. Для экстракции аминов из
животных тканей можно применять гомогенизацию с помощью кислотной
обработки [0,1-0,4 М HCIO4, 10%-ной трихлоруксусной кислотой, смесью
ацетон/1 М НС1 (95:5)]. Как указывалось выше, алифатические амины и ^-
фенетилами-ны нельзя экстрагировать органическими растворителями из их
водных растворов, поскольку эти амины хорошо растворимы в воде. Провести
концентрирование больших объемов кислотных растворов так, чтобы оно не
сопровождалось потерей микрокомпонентов, очень сложно из-за летучести
некоторых низкомолекулярных аминов. Концентрирование нейтрализованных
растворов также, как выяснилось, сопровождается большими потерями. Решить
эту проблему можно, используя ион-парную экстракцию [86]. Соединения
аммония, первичные, вторичные и третичные амины образуют ионные пары с
анионами. Ионные пары, экстрагируемые органическими растворителями,
образуют 3,5-ди-7'рет'-бутил-2-гидроксибензолсульфонат [87], тетрафе-
нилборат [88], антрацен-2-сульфонат [89] и диметоксиантрацен-
2-сульфонат [90], а также ряд других соединений [91, 92].
Ароматические амины и некоторые (5-фенилэтиламины можно экстрагировать
из щелочных водных растворов органическими растворителями, а полиамины
спермидин и спермин часто экстрагируют н-бутанолом перед
хроматографическим разделением.
Важную роль играет предварительное разделение (фракционирование)
биогенных аминов при помощи ионообменной
хроматографии с последующим определением аминов в получаемых фракциях с
использованием специфических методов. Этот
Биогенные амины 357
подход был применен при разработке наиболее автоматизированного способа
анализа аминокислот, в основу которого положена ионообменная колоночная
хроматография [95]. Успехи, достигнутые в разработке ионообменных смол в
последние 20 лет, способствовали их использованию для разделения аминов,
в том числе и для предварительного разделения. Широкое распространение
получили карбоксиметилцеллюлоза [96], сульфированные полистиролы и другие
типы катионообменных смол (дауэкс 50X8, амберлит CG-50 или CG-100 и
биорекс 70) [97]. Амины элюируют растворами солей, концентрации которых и
pH в процессе элюирования меняются, и при помощи специфических методов
определяют содержание каждой из промежуточных фракций.
6.2.1.2. Катехоламины и другие ароматические амины. Выбор конкретного
метода подготовки к хроматографическому разделению проб, содержащих
катехоламины и серотонины, в большой степени зависит от селективности
неподвижной фазы. Следует иметь в виду, что флуоресцентные методы
обнаружения (тригидроксииндольный метод) [93] сами по себе не обладают
достаточной специфичностью и позволяют осуществлять только групповое
определение катехоламинов [94]. Однако если после аналогичной обработки
пробы проводят ее разделение при помощи такого эффективного метода, как
ВЭЖХ, то тот же флуоресцентный метод позволяет обнаруживать отдельные
амины. Если используется неселективный метод обнаружения, то его
возможности могут быть расширены путем обработки пробы с помощью
селективного окисления [98]. Это, однако, неудобно, если применяется
эффективная разделительная система.
Таким образом, основная задача предварительной обработки пробы перед
проведением разделения методом ВЭЖХ состоит в отделении катехоламинов и
их метаболитов от других компонентов пробы. Катехоламины и метанефрины
можно отделить адсорбцией на катионообменниках в протонированной форме
[97]. Включение стадии экстракции позволяет повысить селективность
выделения, например, метанефринов1 [97]. Для отделения катехоламинов от
биогенных аминов других типов можно провести селективную обратимую
адсорбцию на активированном оксиде алюминия [99-101]. Осуществляют эту
операцию следующим образом. После добавления небольшого количества
(обычно 100 г и менее) промытого кислотой оксида алюминия pH элюата,
полученного на предшествующей стадии ионообменного разделения, доводят до
8,6 (чаще всего добавляя 0,5 М трис-буфер). Поскольку образующийся
устойчивый комплекс удерживается достаточно сильно, оксид алюминия можно
промыть для того, чтобы удалить ненужные соединения. Промывку
358 Глава 6
Рис. 6.2. Очистка метаболитов тирозина.
М - метанефрин, NM - норметанефрнн, 3-МТ - 3-метокситнрамнн, DA -
дофамин, EPI - эпннефрнн, NE - норэпннефрин. MHPG - З-метоксн-4-
гидроксифенилгликоль,
УМА - ванилнлминдальная кислота, HVA - гомованилиновая кислота, DOPAC -
3,4 ди-гидрокснфеннлуксусная кислота.
обычно проводят смесью, содержащей 100 мл дважды дистиллированной воды,
100 мкл 0,1 М раствора ЫаНСОз и 1 мл 0,5 М трис-буфера (pH 8,6).
Катехоламины элюируют разбавленным водным раствором кислоты (0,1 м HCIO4
или 0,1 М НС1). Однако если адсорбент недостаточно хорошо активирован,
