Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
конкретных примерах в ряде работ [111 - 113].
fi.3. Колоночная жидкостная хроматография биогенных аминов
6.3.1. Ионообменная хроматография
6.3.1.1. Алифатические амины, р-фенилэтиламииы, ди- и полиамины. Метод
иониого обмена используется для разделения биогенных аминов уже
достаточно давно. Еще в 1958 г. были разработаны устройства для
автоматического анализа амино-
Биогенные амины 361
кислот [95]. Многие исследователи [114-120] успешно осуществляли
разделение различных аминов на колонках, заполненных сульфированными
полистирольными смолами, элюируя амины при программируемом изменении pH
или концентрации солей. Как и ароматические аминокислоты, ароматические
амины довольно интенсивно взаимодействуют с полимерной матрицей. Поэтому
порядок элюирования аминов не вполне соответствует предполагаемому исходя
из ион-конкурентного равновесия.
Выбранные авторами перечисленных выше работ катионообменные смолы
позволили осуществить полное разделение смесей биогенных аминов.
Объединяя ионообменную хроматографию с другими селективными методами
разделения (бумажной хроматографией, электрофорезом на бумаге), можно
определять алифатические амины и фенилэтиламины в тканях мозга, моче и
спинномозговой жидкости [114, 115, 121-125]. Дальнейшее развитие этого
направления привело к разработке методики, предусматривающей в качестве
основной стадии подготовки проб их обработку на небольших ионообменных
колонках с последующим разделением методом ВЭЖХ.
В некоторых случаях этот же метод применялся для разделения ди- и
полиаминов. Как правило, обычные аминокислотные анализаторы в принципе
пригодны для разделения полиаминов, причем обнаружение их осуществляют
при помощи нингидрино-вого метода [126-129]. Как и аминокислоты,
полиамины элюируют при программируемом изменении pH и концентрации
элюента. При помощи флуорескамина (4-фенилспирофура-но-2 (ЗН) ,Г-фталан-
3,3'-диона) [130, 130а] можно обнаружить пикомоли аминокислот [131] и
аминов [132-134]. Еще одно преимущество флуорескамина - большая скорость
взаимодействия с аминами даже при комнатной температуре (миллисекунды).
Избыток флуорескамина можно гидролизовать до нефлуоресцирующих продуктов.
Смешивая элюат с 2 М борат-ным буфером (pH 9,0), получают оптимальное
значение pH для реакции с флуорескамином, в то же время борная кислота
предохраняет некоторые катехоламины от окислительного расщепления [134].
Кроме флуорескамина можно использовать фталевый диальдегид [153],
образующий в присутствии 2-меркаптоэтанола сильно флуоресцирующий
продукт. Если разделение путресцина и спермидина проводится на
современных ионообменных смолах и в качестве обнаруживающего реагента
применяется фталевый альдегид, предел обнаружения при проведении рутинных
анализов составляет 12-15 пмоль.
6.3.1.2. Катехол- и индоламины и их метаболиты. Разработка
микрогранулированных химически модифицированных ионообменных материалов
на основе стекла и диоксида кремния
362
Глава 6
Рис. 6.4. Разделение стандартной смеси путресцина (/), гистамина (2),
кадаверина (3), спермидина (4) и спермина (5) (1 нмоль каждого).
Колонка: дуррум DC GA 50X4 мм; элюент: цитрат натрия, 29,4 г/л, pH 5.2;
градиентное элюирование; добавление различных количеств K/N'aCl; объемная
скорость: 51 мл/ч; температура: 67 °С; обнапу.ксние; по флуоресценции.
355 (возбуждение) и 418 нм (испускание); нослеколоночная обработка
фталевым альдегидом/меркаптоэтанолом.
сыграла важную роль в развитии хроматографических методов анализа
биогенных аминов; На колонках с катионообменника-ми можно проводить
разделение исходных катехоламинов, проявляющих основные свойства.
Соответственно для метаболитов катехоламинов с кислотными свойствами и их
сульфопро-изводных с успехом применяются анионообменники. Хотя и ка-
тионо- и анионообменники вполне пригодны для разделения соответственно
основных аминов и их кислых метаболитов, если анализируемая смесь
содержит одновременно и катехоламины, и их карбоксильные метаболиты,
разделение осуществляется недостаточно эффективно. Ни один из вариантов
методики не дает вполне удовлетворительных результатов.
Влияние ионной силы и pH элюента на время удерживания некоторых
катехоламинов на колонке с катионообменником, иллюстрирует табл. 6.3.
Необходимо отметить, что при разделении органических соединений
ионообменная хроматография представляет собой особый вид обращенно-
фазовой хроматографии, предусматривающей как электростатическое, так и
гидрофобные взаимодействия. Очень высокая селективность разделения
наблюдается
Биогенные амины 363
Таблица 6.2. Примеры разделения норадреналнна и адреналина при помощи
ВЭЖХ на ионообменниках
Неподвижная фаза Размеры Элюент Объемная Лите
колонки, скорость, ратура
мХММ8 мл/мин
Зипакс SCX 2,1X1,0 0,1 М CH3COONa в 0,02 М 1,0 136
