Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
па неполярной неподвижной фазе в качестве элюента следует выбирать
буферные растворы на основе фосфорной [143], азотной, трихлоруксусной и
уксусной кислот [148, 154]. На время удерживания влияет наличие в элюенте
(и концентрация) органических добавок (ацетонитрила, метанола,
пропанола), а также pH элюента. С увеличением pH уменьшается время
удерживания кислотных компонентов и увеличивается время удерживания
соединений, обладающих основными свойствами, но при высоких pH
катехоламин (основание) легко окисляется [155], а стабильность работы
колонки в щелочной среде уменьшается. Уменьшение времени удерживания с
увеличением степени диссоциации ионогенных групп разделяемых соединений
указывает на доминирующую роль гидрофобных взаимодействий и пренебрежимо
малое значение электростатических взаимодействий при разделении методом
обращенно-фазовой хроматографии. Влияние pH элюента на удерживание
катехоламинов иллюстрирует рис. 6.7.
366 Глава 6
Рис. 6.7. Влияние pH на время удерживания кислотных метаболитов
катехоламинов (а) и исходных катехоламинов (б) (аналогично [143]).
Колонка: партнсил 1025 ODS; элюент: 0.1 М фосфатный буфер; объемная
скорость: I мл/мни; температура 25 °С (аналогично (/431).
/ - гомованилнноная кислота: 2 - 3.4-дигидроксифенилуксусная кислота;
3 - ванилил-
миндальная кислота; 4 - 3,4-днгидроксиминдальная кислота; 5 -
паранефрин; 6 - З-О-метилдофамин; 7 - метанефрии: 8 - тирамин; 9 -
эпинефрии; 10 - норэпинефрин.
Разделение соединений с основными свойствами в обращен-но-фазовых
системах провести сложно, если система характеризуется низкой
селективностью и пики имеют длинные хвосты [144, 148], по-видимому, из-за
сильного взаимодействия сильно полярных групп разделяемых соединений с
несиланизированны-ми центрами на поверхности носителя. Добавление в
элюент натриевых солей неорганических кислот, например 0,05--0,2 М
перхлората натрия, может значительно уменьшить асимметричность пиков и
повысить эффективность разделения [148]. Кроме того, перхлорат натрия
влияет на время удерживания кислотных или основных компонентов.
Следует, однако, отметить, что ни добавление перхлората натрия, ни
варьирование величины pH и содержания пропанола не позволяют добиться
полного разделения исходных веществ с основными свойствами и их кислотных
метаболитов. Обычные обращенно-фазовые хроматографические системы
наиболее пригодны для разделения метаболитов с кислотными свойствами и
менее приемлемы для разделения органических оснований.
Биогенные амины 367
Рис. С.8. Экспресс-разделение стандартной смеси кислотных метаболитов
катехоламина методом обращенно-фазовой хроматографии.
Колонка: Cg-привитый силикагель. 250 мм; элюент; 0,02 М цитрат лития (pH
2,50) + +3 об. % н-приианола + 0.2 М. NaC104; температура; 25 °С
(аналогично [1481).
/ - 3,4-дигидроксиминдальиая кислота; 2 - ванилилмнндальная кислота; 3 -
2,5-дигидро-ксифеиилуксусная кислота; 4 - 3,4-днгидроксифеиилуксусиая
кислота; 5 - 5-гидроксиин-дол-3-уксусная кислота; 6 - гомованилниойая
кислота.
Разделение при помощи динамического катионообмена (детергентная
хроматография). Эта методика предусматривает использование неподвижной
фазы для обращенно-фазовой хроматографии в сочетании с гидрофильным
элюентом, содержащим органический модификатор и небольшое (0,1% или
менее) количество поверхностно-активного вещества (ПАВ).
ПАВ, например 1-додецил- или лаурилсульфат натрия, или
додецилбензолсульфонат натрия, адсорбируются на гидрофобной поверхности
неподвижной фазы, образуя анионный слой, вследствие чего она приобретает
свойства ионообменника. Получаемая таким образом динамическая
катионообменная система, как выяснилось, пригодна для разделения
аминокислот [147] и катехоламинов [58, 144]. Разделение метаболитов
катехоламина, обладающих кислотными свойствами, происходит главным
образом по механизму распределительной хроматографии [155]. Влияние на
время удерживания и эффективность разделения катехоламина и его
метаболитов добавления в элюент додецилсульфата натрия иллюстрирует рис.
6.9. На скорость разделения, его селективность и разрешение существенное
влияние оказывают концентрация додецилсульфат-анионов и катионов натрия
(противоионы), природа и концентрация органического модификатора (или
кислоты), наличие солей. Динамические катионообменные системы такого типа
в принципе подобны обычным ионообменным системам, поэтому влияние
различных факторов на время удерживания предска-
368 Глава О
100
к
З-М-Тугт
Тугт
З-Н-Тугт
Isopren
70
мн
NM
Syn
Dopa/NSyn
Е
NE
HVA
5-НГАА
DOPAC
1
HGA
VMA
DOMA
без додецилсульфата натрия
С 0.03% додецилсульфата натрия
Рис. 6.9. Влияние добавок додецилсульфата натрня на коэффициент емкости
катехоламинов и их производных.
Колонка: С9-привитый силохром; элюент: а - 0,02 М лимоииая кислота (pH
2.50) +
+3 об. % и-пропанола+0,2 М NaCIO,: температура: 25 "С, 6 - 0.02 М
