Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
тогда как максимумы возбуждения индолов соответствуют 210-220 и 270-280
нм, а максимумы испускания 360 нм. Спектры возбуждения 'и испускания
производных катехинов и индолов также различаются, сдвиг максимумов в них
обусловлен батохром-ным эффектом. Предел обнаружения немодифицированных
индолов и катехинов составляет соответственно 5-25 и 100- 500 пг.
Согласно данным работы [188], предел обнаружения тригидроксииндольных
производных норадреналина и адреноли-на составляет 1 пг, что говорит о
возможных резервах увеличения чувствительности метода. Когда осуществляют
возбуждение при 280 нм, а испускание происходит при 310-315 нм,
наблюдается значительное уменьшение индольного пика, а интенсивность
испускания катехоламина меняется слабо, что
Биогенные амины 371
Рис. 6.11. Образование флуоресцирующих
производных дан--сн2сн2он силхлорида (/), флуорескамм-на (2) и фталевого
диальдеги-да (3).
и
О
позволяет дополнительно увеличить селективность обнаружения катехоламинов
в присутствии индолов [81]. Возбуждение при 200 нм облегчает обнаружение
катехоламинов и серотонина, при этом предел обнаружения других индолов
значительно снижается, а также существенно уменьшается селективность
обнаружения катехоламинов относительно индолов.
6.4.2. Окрашенные и флуоресцентные производные
Обнаружение биогенных аминов, содержащих первичные и вторичные
аминогруппы, в виде окрашенных производных применяется в ограниченных
пределах главным образом из-за недостаточно высокой чувствительности
метода (предел обнаружения соответствует наномолю). В качестве реагентов,
предназначенных для получения окрашенных производных, широкое
распространение получили только 2,4-динитрофторбензол (реагент Сэнгера
[158, 159]) и 2,4-динитробензолсульфоновая кислота [160]. Оба этих
реагента дают производные одинакового состава. После того как были
разработаны методы синтеза флуоресцирующих производных, отпала
необходимость в получении окрашенных производных.
Для получения флуоресцирующих производных может быть рекомендован
широкий круг реагентов [176]. Таковыми являются сульфохлориды: 5-
диметиламинонафталин-1-сульфохлорид
(ДНС-С1), 5-ди-я-бутиламинонафталин-1-сульфохлорид [158, 159], 6-
метиланилинонафталин-2-сульфохлорид [160] и 2-я-хлор-сульфофенил-3-
фенилиндан [161, 162], изотиоционаты: 4-диме-
тиламинонафталин-1-изотиоцианат [163], флуоресцеинизотио-
24*
372 Глава 6
дианат [164] и 9-изотиоцианатакридин [165], альдегиды: фталевый альдегид
и пиридоксаль [166, 167], 4-фенилспирофу-ран-2(ЗН),1/-фталан-3,3,-дион
(флуорескамин).
Из числа приведенных выше реагентов в колоночной жидкостной
хроматографии широко применяются только ДНС-С1 [168-172], флуорескамин
[133] и фталевый альдегид [173-175]. Получение окрашенных производных
может проводиться как до, так и после хроматографического разделения
[176]. Реакцию с ДНС-С1 лучше проводить до разделения, тогда как
флуорескамин и фталевый альдегид широко используют как для
предколоночной, так и послеколоночной обработки исследуемых соединений.
ДНС-С1 реагирует с первичными и вторичными аминогруппами, а также с
фенолами и имидазолами с образованием сильнофлуоресцирующих производных
[177--180]. Этот реагент нашел применение во многих лабораториях
преимущественно для идентификации ди- и полиаминов [170, 171, 181]. Амины
указанного типа очень хорошо растворимы в воде, и их разделение
рекомендуется проводить только при помощи ионообменной хроматографии,
которая требует достаточно больших затрат времени. К современной ВЭЖХ
можно прибегать после введения в молекулы исследуемых аминов хромофоров
или флуорофоров с тем, чтобы облегчить обнаружение аминов [182] и
одновременно повысить их липофильность. Флуорескамин и фталевый альдегид
реагируют с первичными аминами с большой скоростью, что позволяет
использовать эти реагенты не только для предколоночной, но и
послеколоночной обработки аминов. Замена нингидрина на флуорескамин в
аминокислотных анализаторах (1973 г.) повысила чувствительность анализа в
100 раз [132]. Методики анализа, включающие стадии предварительного
получения производных и последующего их разделения при помощи ВЭЖХ,
превосходят методики, основанные на ионообменном разделении, как по
селективности, так и по скорости анализа. Более того, предколоночная
обработка повышает стабильность соединений и облегчает их экстракцию.
Однако пдедколоночное получение производных исследуемых соединений
проводится все же главным образом потому, что предел обнаружения
разделяемых методом ВЭЖХ производных фталевого альдегида [153, 183, 184],
флуорескамина [134, 185, 186] и других реагентов, образующих
флуоресцирующие соединения, можно снизить до нанограммового уровня.
6.4.3. Электрохимическое обнаружение
Поскольку в современных ионообменных и обращенно-фазовых системах
допустимо использование водных элюентов, обнаружение аминов можно
проводить электрохимическими методами.
