Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Биогенные амины 373
При помощи электрохимических детекторов осуществляют обнаружение в
основном катехоламинов, а также некоторых индолов.
Об анодном окислении фенолов и индолов стало известно по крайней мере
50 лет назад, однако эта реакция не привлекала особого внимания
исследователей, поскольку все катехины реагируют в данном случае
одинаково и различить их не представляется возможным. Очевидно, что
только путем объединения электрохимического окисления соединений и
последующего их хроматографического разделения можно достичь успеха.
Положительную роль в данном случае играет и тот факт, что в современных
хроматографических системах в состав подвижных фаз вводят растворители,
полностью диссоциирующие на ионы и характеризующиеся высокой
проводимостью. В процессе анодного окисления катехоламинов (на графитовом
или стеклоуглеродном электроде) образуются о-хинон, два протона и два
электрона (рис. 6.12).
Рис. 6.12. Двухэлектронное окисление катехоламинов н последующее
образование дигидроиндолов при контролируемом pH.
Предельный ток для окисления дофамина достигается при значении
потенциала 0,60 В, для норметанефрина - при 0,80 В. Вольтамперограмма
гомованилиновой кислоты имеет максимум при 0,60 В. Для индолов характерна
двойная схема окисления, поскольку происходят N-окисление, а также
окисление фенольной группы 5-гидроксисоединений [197]. Представитель
этого класса соединений - 5-гидрокситриптамин (серотонин), на его
вольтамперограмме при 0,60 В наблюдается плато, а дальнейшее увеличение
потенциала приводит к усилению тока (рис. 6.13). При окислении аминов, не
содержащих фенольной группы, например триптамина, предельный ток не
наблюдается до 1,10 В. Почти селективное обнаружение 5-гидроксисоединений
можно осуществить при 0,60 В, поскольку анодное окисление 5-гидроксигрупп
начинается при более низком потенциале, чем N-окисление.
Увеличение чувствительности аналитической системы до предела,
позволяющего обнаружить соединение, концентрация которого составляет 10-
9% (или менее), удовлетворяющего требованиям анализа эндо- и экзогенных
веществ в биологических пробах, осложнено по ряду причин: в указанных
условиях трудно добиться необходимой воспроизводимости, трудно скон-
374 Глава б
Рис. 6.13. Вольтамперограмма гомо-ванилиновой кислоты (/), дофамина (.2),
норметанефрина (3) и серотонина (4).
и,В,
струировать такую установку, которая была бы достаточно практична и
работать с которой было бы достаточно просто. Такие же проблемы возникают
и при осуществлении электрохимического обнаружения. Несмотря на
тщательную дегазацию элюентов и заземление, в системе нередко появляются
шумы и нарушается стабильность сигнала, что препятствует использованию
электрохимических детекторов для рутинных анализов.
Электрохимические процессы осуществляются на поверхности раздела фаз
(на поверхности электрода), поэтому детекторы этого типа очень
чувствительны даже к небольшим изменениям состава элюента. Именно по этой
причине на хроматограммах, получаемых при электрохимических методах
обнаружения, наблюдается большой начальный пик, соответствующий фронту
растворителя; если же в системе используется детектор по флуоресценции,
такой пик отсутствует.
6.5. Применение
Объединение методов эффективного хроматографического разделения и
высокочувствительного флуоресцентного или амперометрического обнаружения
(на уровне пикограммовых количеств) впервые позволило решить задачу
одновременного определения содержания влияющих на нервную деятельность
биогенных аминов и их метаболитов в локальных участках головного мозга, в
крови или животных тканях. В табл. 6.4 приведены некоторые конкретные
примеры практического при-
Таблица 6,4. Некоторые примеры применения ВЭЖХ в сочетании с
амперометрическими и флуоресцентными методами обнаружения в
нейрохимических исследованиях
Соединение
Серотонин
Норэпинефрин, дофамин
Дофамин, норэпинефрин, 5-Гидрокснтриптофан, серотонин, 5-Гидро-
ксииндолил-3-уксусная кислота Дофамин, метаболиты Норэпинефрин
Норэпинефрин,
дофамни ДОФА, 3,4-дигидрокси-фенилуксусная кислота, норэпинефрин, эпи-
нефрин, дофамин
Дофамин, норэпинефрин, эпинефрин
Норэпинефрин, эпинефрин
Дофамин, норэпинефрин, эпинефрин Эпинефрин
Норэпинефрин, эпинефрин
Норэпинефрин, дофамин, серотонин, тнрамин
Норэпинефрин, дофамин,
4-гидроксифеиилуксус-ная кислота Норэпинефрин, дофамин, серотонин
Норэпинефрин, эпинефрин
Норэпинефрин, эпинефрин, ДОФА, дофамин,
3,4-дигндроксифенил-уксусная кислота ДОФА, метаболиты
Проба
Кровь, плазма, сыворотка
Кровь, плазма, сыворотка
Гомогенат ткани
Среда инкубирования Кровь, плазма, сыворотка Гомогенат ткани Гомогенат
ткани
Моча
Кровь, плазма, сыворотка
Моча
Гомогенат ткани
Гомогенат тканп
Кровь, плазма, сыворотка
Кровь, моча, гомогенат ткани, моча
Гомогенат ткани
Гомогенат ткани
Кровь, плазма, сыворотка
