Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
2,1X1,0 НС1 (pH 6,3) 1,4 136
0,05 М СНзСООЫа в 0,01 М
2,1X1,0 НС1 0,5 136
0,075 М NaH2P04
2,1X1,0 0,15 М NaH2P04 0,4 136
2,1X1,0 0,05---0,45 М NaH2PO< 0,4 136
2,0X0,5 0,1 М НСЮ" 0,3 137
Дю понт SCX 3,0X1,2 0,1---1 М (NH4)3P04 (pH 7,0) 1,0 138
Видак (катионо- 2,0X0,5 0,01 М H2S04 ---0,04 М Na2S04 0,4 136
обменник) 4,6X0,25 0,5 М NH4H2P04 (pH 4,36) 0,76 136
Партксил-10 SCX
я Внутренний диаметр.
при использовании ион-парной хроматографии [140, 141] или динамических
катионообменных хроматографических систем [59, 142-150].
6.3.2. Обращенно-фазовая распределительная хроматография
6.3.2.1. Алифатические амины, (3-фенилэтиламины, ди- и полиамины.
Значительные успехи в области разделения биологических объектов стали
возможны благодаря появлению химически модифицированных неподвижных фаз.
Наибольшая селективность и эффективность были достигнуты при разделе-
Таблица 6.3. Влияние ионной силы и pH на время удерживания катехоламинов
[137]а
Концентрация pH Время удержнвання, мин
Норадре- Адреналин Дофамнн
налнн
0,2 5,1 5,6 10,0 18,5
0,1 5,1 5,6 10,2 18,6
0,05 5,1 8,0 13,4 23,4
0,2 4,4 3,9 6,4 11,5
0,075 3,65 3,2 4,8 8,4
Условия хроматографического разделения: колонка
500X2,1 мм; смола хнтачи ЗОН с, температура колонки 30 °С, объемная
скорость 1,5 мл/мни.
364 Глава 6
70 20
30 о
i, мин________
10
20 30
АО
Рис. 6.5. Разделение об-р ;i щенио-фазовой ВЭЖХ биогенных амннов плазмы
крови в виде производных фталевого альдегида [153].
Образец: 5 мкл (эквивалентно 0,05 мл плазмы кровн); колонка: ji-
бондапак 300Х
Х4 мм; эл^юонт: 0,05 М
N0H2PO4 (pH 5,10) с 480 мл/л метанола: объемная ско-
рость: 1,5 мл/мни; температура: 35 °С.
/ - 5-гндроксииндол; 2 - иорэпинефрнн; -дофамин; 4 - тирамнн; 5 -
иормета-нсфрнн.
ним на неподвижных фазах типа щеток - силикагелевых носителях с привитыми
Се- или Cie-группами. Очевидно, что этот метод целесообразно использовать
и для разделения биогенных аминов. Однако хроматографирование
алифатических аминов, диаминов и полиаминов на указанных фазах затруднено
из-за их полярности, а также отсутствия подходящего хромофора, что
чрезвычайно усложняет обнаружение.
Модифицирование биогенных аминов флуорофорами позволяет получать
липофильные молекулы, для обнаружения даже очень малых концентраций
которых пригодны детекторы по флуоресценции. Модифицирование аминов можно
проводить дансилхлоридом [151], флуорескамином [96] или фталевым
лнальдегидом [153] (в последнем случае в присутстви 2-меркап-тоэтанола).
Проводя разделение указанных производных аминов методом обращенно-фазовой
хроматографии, можно обнаруживать нано- и даже пикограммовые количества
аминов, причем гораздо быстрее, чем при использовании ионообменной
хроматографии. Правда, не следует забывать, что данная методика включает
дополнительную стадию - стадию получения производных.
Необходимо также отметить, что флуорескамин и фталевый диальдегид
реагируют только с первичными аминами, а дан-силхлорид - как с
первичными, так и с вторичными.
Биогенные амины Зб5
О.Г,
Рис. 6.6. Хроматограмма З-О-метилиро-ванных метаболитов дофамина.
Колонка: партнснл 1025 ODS; элюент: 50 мМ КН2Р04 {pH 4,6):
объемная скорость:
0.66 мл/мнн; температура: 25 °С (аналогично [1431).
/ - З-мсюкси-4-гндроксиминдальная кислота; 2 - норметпнефрин; 3 -
метанефрнн; 4 - 3-мс-токснтирамнн; 5 - З-мстоксн-4-гндроксифеиил-уксуоная
кислота; 6 - паранефрии; 7 - 3-ме-токси-4-гидрокеифеиэтаиол.
t, мин
6.3.2.2. Катехол- и индоламины и их метаболиты. Метаболиты катехол-
и индоламина в отличие от исходных соединений обладают кислотными
свойствами. Анионо- или катионообменная хроматография может быть
использована для разделения производных катехина с соответственно только
кислотными или основными свойствами, тогда как обращенно-фазовая
распределительная хроматография позволяет разделять соединения обоих
классов в течение одного анализа. В обычной обращенно-фазовой
хроматографии доминируют гидрофобные взаимодействия между растворенными
молекулами и алифатическими группами, химически привитыми к поверхности
носителя, а для ион-парной (динамический ионный обмен) методики
характерно одовременное электростатическое и гидрофобное взаимодействие.
Обращенно-фазовая хроматография. Для разделения производных катехина
