Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
218
Глава 9
Таблица 5. Некоторые плазмиды-«помощники» для мобилизации векторов
Плазмида Репликон Группа не Селективный Литература
совмести маркер1)
мости
pLG221 Coll-b drd-1 1а Кт [24]
pLG223 Coll-b drd-1 1а Тс [24}
R64drd-11 R64 1а Sm [91
RK2/RPU --- Р-1 Тс, Ар, Кт [51
pSa322 Sa/pBR322 W Ар [14]
1) Сокращения см. в примечании к табл. 1.
ным препаратом, метод мобилизации плазмид обычно быстрее и проще. Многие из описанных в этой главе плазмидных векторов, хотя сами по себе и нетрансмиссибельны, могут передаваться многим реципиентам путем мобилизации. Это свойство определяется присутствием в векторном репликоне детерминант mob, oriT (участок начала переноса) и nic (одноцепочечный разрыв, вносимый релаксационным комплексом). Эти участки картированы в плазмидах RSF1010 и RK2 [5, 9]. Другой необходимый компонент системы — наличие в донорной клетке плаз-миды-«помощника», несущей гены переноса (tra), необходимые для транспорта вектора в штамм-реципиент. Роль «помощника» с высокой эффективностью могут выполнять различные трансмиссибельные плазмиды (см. табл. 5). RP4, например, мобилизует производные RSF1010, в частности рКТ230, с частотой переноса 7,5-10-1 на 1 донорную клетку [9]. Удивительна и практически полезна способность плазмид incloc, таких, как pLG221, стимулировать перенос векторов в большое число различных реципиентов [24] (Франклин и Боулнойс, неопубликованные данные). Спектр хозяев для плазмид incla ограничен Е. coli и близкородственными бактериями. Следовательно, при переносе векторных плазмид, например, в Pseudomonas сами они не смогут перейти в эти бактерии. Таким образом, перенос вектора или рекомбинантной плазмиды можно провести без мешающего переноса плазмиды-«помощника». Ниже описаны два сходных метода мобилизации. Первый из них удобен для переноса одного или немногих клонированных плазмид, а второй приспособлен для экспериментов, в которых требуется перенос большого числа плазмид, например для скрининга космидных библиотек.
3.4.1. Мобилизация одного или немногих клоиов
1. Вырастите 5 мл культуры донорных (штамм, содержащий переносимую плазмиду и плазмиду-помощник) и реципиентных клеток на L-бульоне в течение ночи при 30 °С. Среда для выра-
Векторы для грамотрицательных бактерий
219
щивания донорных бактерий должна содержать антибиотики, устойчивость к которым кодируется плазмидами.
2. Положите на чашку с L-агаром нитроцеллюлозный фильтр диаметром 10 мм (например, Millipore HAWPO 1300 с размером пор 0,45 мкм или эквивалентный другой фирмы).
3. Нанесите на фильтр по 10 мкл суспензии донорных и ре-ципиентных бактерий. Проинкубируйте 6—15 ч при 30/37 °С.
4. Перенесите фильтр в пробирку, содержащую 1 мл 0,9% NaCl. Суспендируйте клетки на механическом встряхивателе.
5. Разведите суспензию клеток и рассейте на среде, необходимой для селекции несущего плазмиду штамма-реципиента.
3.4.2. Мобилизация большого числа клонов
1. Засейте индивидуальными колониями донорных бактерий микротитровальный планшет с 96 лунками, содержащими по
0,1 мл L-бульона с нужными антибиотиками. Проинкубируйте ночь при 37 °С.
2. Засейте 5 мл L-бульона реципиентными клетками и инкубируйте в течение ночи при 30/37 °С.
3. Нанесите 0,1 мл культуры реципиентных клеток на всю поверхность чашки с L-агаром. На один планшет донорных бактерий требуются две чашки.
4. Перенесите небольшие аликвоты (5—10 мкл) донорного штамма на поверхность засеянного реципиентными клетками агара. Удобнее всего использовать стерильную гребенку с 48 зубцами, расположенными в блоке 6x8 так, что их можно окунуть в половину лунок микротитровального планшета. Таким образом за один раз можно перенести 48 клонов. Проинкубируйте чашки 6—12 ч при 30/37 °С.
5. Приготовьте чашку-реплику [23] на среде, необходимой для селекции несущего плазмиду штамма-реципиента.
4. Векторы с широким спектром хозяев для специальных целей
Многие из имеющихся сегодня векторов Е. coli обладают свойствами, необходимыми для каких-либо конкретных целей. Типичные примеры — это экспрессирующие векторы [19], плазмиды для клонирования таких последовательностей, как промоторы и терминаторы [25], векторы для прямого обнаружения или селекции рекомбинантов [26], малокопийные векторы и плазм иды (косм иды), пригодные для клонирования больших фрагментов ДНК (нужных при конструировании геномных библиотек) [27]. Сейчас появляются подобные векторы с широким спектром хозяев. Пока, правда, они не настолько совершенны, как векторы для Е. coli, однако обладают преимуществами при анализе генов из необычных бактерий.
220
Глава 9
4.1. Космиды с широким спектром хозяев
