Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 98

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 253 >> Следующая

Метод упаковки ДНК в частицы фага % in vitro позволяет использовать космиды (плазмиды, содержащие cos-еайт фага К) для клонирования в Е. coli фрагментов ДНК длиной 30— 40 т.п.н. Потенциально данный метод весьма полезен для генетического анализа грамотрицательных бактерий. В настоящее время разработана двустадийная процедура, основанная на RSFlOlO-космиде, используемой в сочетании с мобилизацией, описанной в разд. 3.4.2.
Хотя сконструировано довольно много космид с широким спектром хозяев [28, 29], все они, за исключением рММВЗЗ и рММВ34 [30], имеют ограниченное применение. Некоторые из них нестабильны, другие не содержат уникальных сайтов для BamHl или BglII, необходимых для клонирования фрагментов, получаемых при частичном расщеплении Sau3A или MbOI. Кроме того, если сайт клонирования не дефосфорилирован, все они при лигировании образуют поликосмиды.
Космиды рММВЗЗ (рис. 3) и рММВ34 сконструированы на основе репликона RSF1010 и имеют длину 13,75 т.п.н. Они отличаются лишь ориентацией Bs^EII/#paI фрагмента, содержащего ген устойчивости к Кт и cos-еайт фага X. Важным этапом при конструировании этих плазмид было превращение Hpal-сайта плазмиды RSF1010 (расположенного между сайтами ?coRI и Ss/I) при помощи синтетических линкеров в сайт для BamHl. Эти векторы успешно использовались для конструирования геномных библиотек нескольких грамотрицательных бактерий, включая ряд видов Pseudomonas и Thiobacillus [30].
4.1.1. Клонирование в рММВЗЗ и рММВЗД
Общая стратегия клонирования представлена на рис. 3.
1. Разделите 5 мкг векторной ДНК (количество при необходимости можно изменить) на 2 аликвоты. Обработайте одну Hpal, а другую — Smal.
2. Остановите реакцию прогревом при 70 °С в течение 10 мин.
3. Для проверки полноты расщепления проанализируйте с помощью электрофореза в агарозном геле небольшую часть обеих реакционных смесей.
4. Полностью расщепите оба препарата BamHl.
5. Частично расщепите высокомолекулярную (~100 т.п.н.) геномную ДНК Sau3A при таких условиях, чтобы основная масса полученных фрагментов имела длину 30—40 т.п.н. После этого фрагменты хромосомной ДНК можно фракционировать по размеру в градиенте концентраций NaCl или сахарозы. Для конструирования геномных библиотек бактерий, однако, в этом
Векторы для грамотрицательных бактерий
221
J BamHI HPaIcos Km BamHI
BamHI
BamHI
. Smal
Лигирование
Hpai
cos Kn.
Фрагмент геномной ДНК (~35т.п.н.), полученный при частичном расщеплении Sau3A высокомолекулярной ДНК smal.'
COS
I
Упаковка лигированной ДНК in vitro с использованием упаковочных энстрзктов фага А
4
Трансфекция реципиента Е. coli
Рис. 3. Космида рММВЗЗ и общая схема клонирования в космидах.
обычно нет необходимости, так как размер их геномов невелик и необходимое число рекомбинантов (~500) можно получить и без селекции по размерам.
6. Лигируйте 1 мкг ДНК «плеч» вектора с 5 мкг расщепленной Sau3A хромосомной ДНК в 25 мкл буфера для лигирования, содержащего 5 мМ MgCb и 5 мМ АТР [30].
7. Упакуйте аликвоты лигированной ДНК объемом 5 мкл, используя упаковочные экстракты фага К, как описано Маниа-тисом с соавт. [19].
8. Вырастите Е. coli DH1 [19] или CF503 [30] в L-бульоне с 0,4% мальтозы до поздней экспоненциальной фазы. Смешай-
222
Глава 9
те 500 мкл этой культуры с 250 мкл упакованной in vitro кос-миды и проинкубируйте 1 ч при 37 °С.
9. Рассейте бактерии для селекции на L-arape, содержащем 50 мкг/мл канамицина.
10. Для сохранения клонов перенесите колонии по одной в лунки микротитровальных планшетов, содержащие по 200 мкл среды для замораживания Хогнесса [L-бульон с добавлением 8,8% глицерина, 3 мМ ацетата натрия; 55 мМ К2НРО4; 26 мМ КН2Р04; 1 мМ MgS04; 15 мМ (NH4)2S04]. Проинкубируйте 6 ч при 37 °С и храните при —70 °С.
Если скрининг клонов необходимо провести не в Е. coli, а в другом генетически отличающемся организме, полезно трансформировать космидами штамм Е. coli, содержащий подходящую плазмиду-помощник (например, CF503). После этого библиотеку можно быстро перенести в нужную бактерию-реципиент, как описано в разд. 3.4.2.
4.2. Регулируемые экспрессирующие векторы с широким спектром хозяев
После того как нужный ген клонирован, необходимо оптимизировать его экспрессию и добиться максимального выхода продукта, для того чтобы иметь этот продукт в количествах, достаточных и для исследований, и для коммерческого использования. Существует множество экспрессирующих векторов, созданных на основе плазмид Е. coli. В них включены хорошо изученные сильные промоторы, такие, как lac UV5, trp или ^PL
[19]. Важное достоинство этих промоторов в том, что их транскрипционная активность может регулироваться специфическими репрессорами. Возможность «выключения» экспрессии позволяет избежать ряда нежелательных эффектов, так как присутствие в больших количествах продукта чужеродного гена в течение всей фазы роста может угнетать размножение клеток.
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed