Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
На основе плазмиды с широким спектром хозяев RSF101Q недавно сконструированы два экспрессирующих вектора (рис. 4). Плазмиды рММВ22 и рММВ24 содержат промотор tac, полученный путем слияния области —35 промотора tpr Е. coli и области —10 промотора lac UV5 [31, 32]. Этот промотор регулируется /ас-репрессором. В ходе конструирования плазмид в них был включен фрагмент, кодирующий ген laclQ, что дает возможность регулирования транскрипционной активности tac-промотора рММВ22 и рММВ24. В плазмиде рММВ22 /ас-промотор находится между ?coRI и ЯтсПП-сайтами рКТ240 [32] так, что транскрипция проходит через .EcoRI-сайт. В рММВ24 ^ас-промотор расположен в обратной ориентации таким образом, что с него транскрибируется фрагмент ДНК, клонированный в ЯшсШ-сайте.
Векторы для грамотрицательных бактерий
223
Рис. 4. Экспрессирующие векторы с tac-промотором рММВ22 и рММВ24.
Главный вопрос при конструировании экспрессирующих век-торов состоял в том, будет ли foc-промотор работать и регулироваться в организмах, генетически отличающихся от Е. coli. Известно, что гены из грамотрицательных организмов, не относящихся к энтеробактериям, плохо экспрессируются в Е. coliT однако обратная ситуация была изучена недостаточно. Недавно удалось показать, что trp-оперон Е. coli эффективно экспрессируется в P. aeruginosa [33]. Из этого следовало, что барьера при переносе генов в этом направлении не существует. Чтобы изучить этот вопрос для генов, транскрибирующихся с tac-промотора экспрессирующих векторов, фрагмент ДНК’, кодирующий фермент катехол-2,3-оксигеназу (К230) [4], был клони-
Таблица 6. Уровни экспрессии катехол-2,3-оксигеназы с использованием полученного на основе RSF1010 экспрессирующего вектора рММВ22
Плазмида1)
Хозяин2)
Промотор3)
Индуктор4)
Активность К230 (мЕд/мин/мкг белка)
pWWO-161 P meta --- 170
pWWO-161 P meta m-MBA 3040
pWWO-161 E meta --- 50
pWWO-161 E meta m-MBA 240
pMMB25 E tac --- 1040
pMMB25 E tac IPTG 20 350
pMMB25 P tac --- 500
pMMB25 P tac IPTG 20 500
О pWWO-161 — производное TOL-плазмиды pWWO со вставкой Ти401 (см. работу [4]): рММВ25— рММВ22, несущая ген К230 pWWO в fcoRI-сайте вектора.
2) Р — P. putida mt-2 КТ2440; Е — Е. coli SK1592.
3) meta — промотор мета-пути pWWO. tac— см. примечание 3 к табл. 9.2.
4) ш-МВА — мета-метилбензиловый спирт. IPTG — изопропилтиогалактозид, 2 мМ для Е. coli, 5 мМ для P. putida.
224
Глава 9
рован в EcoRl-caPne рММВ22. Полученная плазмида была обозначена рММВ25 [32]. Вставка кодировала структурный ген К230 и последовательность Шайна — Далгарно [34], но не содержала промотора. Уровень экспрессии К230 определяли по активности фермента в клеточных экстрактах из Е. coli и P. putida. Результаты приведены в табл. 6. Из представленных данных следует, что уровни активности К.230 в Е. coli и P. putida близки. Более того, в обоих случаях экспрессия выключается /ас-репрессором и индуцируется в присутствии IPTG. Этот факт демонстрирует принципиальную возможность получения эффективной регулируемой экспрессии генов грамотрицатель-ных бактерий при помощи рММВ24 и рММВ22.
На практике при работе с этими плазмидами в Е. coli и P. putida наблюдается лишь одно существенное различие. Для получения максимальной индукции в P. putida требуется несколько большая концентрация IPTG (5 мМ), чем в Е. coli (2 мМ). При работе с другими организмами эта цифра, вероятно, может измениться, и концентрацию IPTG придется подбирать экспериментально.
4.3. Малокопийные векторы с широким спектром хозяев
Для клонирования некоторых генов, например кодирующих мембранные белки, необходимо применять малокопийные векторы, поскольку высокий уровень экспрессии таких генов может быть вредным или даже летальным для клетки. Имеется несколько типов таких векторов (табл. 2). Плазмиды pRK290, pRP301 и pRK2501 получены на основе, по-видимому, идентичных IncP-I конъюгативных плазмид RK2 и RP4. Число копий таких векторов составляет 2—8 на хромосому [13]. Для них характерен такой же широкий спектр хозяев, что и для родительских плазмид. Относительно стабильности этих плазмид в клетках микроорганизмов, отличных от Е. coli, количественных данных нет [13].
Ряд векторов (например, рМЕ290) сконструирован на основе плазмиды pVSI P. aeruginosa [35]. Эти плазмиды обладают небольшим числом копий (около 8) [20] и в случае рМЕ290 невелики по размеру (6,8 т.п.н.) в сравнении с другими подобными векторами. Еще одно интересное свойство, которое необходимо учитывать при работе с pVSI и ее производными, состоит в том, что эти векторы, реплицируясь в Pseudomonas sp. и родственных бактериях, не реплицируются в Е. coli [20].
4.4. Вектор для поиска промоторов на основе RSF1010
Конструирование плазмид, которые можно использовать для идентификации сигнальных последовательностей ДНК, таких, как промоторы и терминаторы, имеет немалое значение для
Векторы для грамотрицательных бактерий
225
Рис. 5. Вектор для поиска промоторов рКТ240. Устойчивость к стрептомицину зависит от наличия нромоторных последовательностей во фрагментах ДНК,
