Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Преимущества бацилл стали очевидны после 1978 г., когда появились первые сообщения об экспериментах по молекулярному клонированию в этих микроорганизмах г 1-3]. Несколько плазмид опробовали в качестве векторов; были предприняты попытки с помощью различных промоторов экспрессировать в бациллярных системах ряд генов млекопитающих и вирусов; продукты некоторых чужеродных генов удалось получить в виде секретируемых молекул [4, 5]. Не следует, однако, думать, что все эксперименты по молекулярному клонированию в бациллах нацелены на экспрессию животных или вирусных генов; подобные опыты могут дать нам множество полезной информации и о самой бактерии, в частности о механизмах споруля-ции [6].
Эта глава написана для тех, кто уже знаком с основными приемами клонирования в Escherichia coli и желает работать с системами на основе Bacillus. Главные трудности, связанные
Методы клонирования в бациллах
231
с использованием в качестве бактерии-хозяина представителей бацилл, заключаются,. во-первых, в нестабильности плазмид (возможны как полная утрата плазмиды, так и разнообразные генетические перестройки) и, во-вторых, в высокой протеазной активности, свойственной некоторым штаммам. Кроме того, плазмидные векторы для Bacillus разработаны далеко не так полно как для Е. coli. В частности, такие сильные контролируемые промоторы, как trp, tac и A,pL, получившие широкое распространение для экспрессии чужеродных генов в Е. coli, не имеют пока столь же удачных аналогов, пригодных для использования в клетках бацилл. Проблемы, связанные с нестабильностью плазмид, могут быть обусловлены гомологичной рекомбинацией [7]. В некоторых случаях их удается обойти, если избежать присутствия в рекомбинантных конструкциях дуплицированных последовательностей. Деградацию продуктов клонированных генов логично предотвращать, используя виды с низкой протеолитической активностью, например В. sphae-ricus.
2. Штаммы и плазмиды
2,1. Бактериальные штаммы
Штаммы В. subtilis, обычно используемые в качестве хозяев для рекомбинантных плазмид, приведены в табл. 1. Пожалуй, наибольшее распространение получил штамм BR151. Почти все стандартные лабораторные штаммы В. subtilis 168 содержат в геноме два профага — PBSX и SPp (8). При индукции PBSX функциональные фаговые частицы не образуются: формирующиеся фаги содержат только бактериальную ДНК [9]. SP[i способен к образованию функциональных частиц, но этот профаг довольно трудно индуцировать. Получены также штаммы, не содержащие в геноме указанных профагов (например, YB886, производный BR151, см. табл. 1).
Многие мутации, вызывающие нарушения споруляции (и в некоторых случаях соответствующее угнетение протеолитической активности), обусловливают также стойкую невосприимчивость клеток по отношению к чужеродной ДНК. Однако несмотря на то, что клетки таких штаммов не способны трансформироваться, полученные из них протопласты оказываются компетентными для трансформации. Были получены мутанты «высокопротеолитической» бактерии В. subtilis, не производящие некоторых протеаз, однако все они по общему уровню про-теолитических ферментов оставляют далеко позади такие виды, как В. sphaericus, В. freundenreichii и В. coagulans. Для осуществления трансформации бактерий рода Bacillus, отличных от В. subtilis, следует работать со сферопластами.
232
Глава 1
Таблица 1. Штаммы В. subtilis, используемые в экспериментах по молекулярному клонированию
Штамм Характеристика Ссылка
BR151 trpC2, metBlO, lys-3 [15]
YB886 trpC2, metBlO, xin-1, SP$~ [16]
МП 12 leuA8, arg-15, thr-5, recE4, r~, m~ [12]
Mil 19 leuB6, trpC2, r~, m~ [12]
MI120 leuB6, recE4, r~, m~ [12]
CU403 thy A, thyB, metB, divIVBI [17]
BD170 trpC2, thr-5 [91
BD224 irpC2, thr-5, recE4 [9]
Аллель гесЕ4 [10] сильно подавляет, хотя и не исключает полностью гомологическую рекомбинацию; плазмиды, несущие последовательности, гомологичные участкам хромосомной ДНК, могут оказаться нестабильными даже в гес?4-штаммах [11]. Как RecE4+-, так и НесЕ~-штаммы одинаково хорошо трансформируются плазмидной ДНК [2].
Система рестрикции штамма В. subtilis 168 и его производных обнаруживает относительно низкую активность в отношении немодифицированной плазмидной ДНК. Хотя эффективность трансформации немодифицированной ДНК часто не отличается от эффективности трансформации модифицированной формой, описаны случаи, когда немодифицированная плазмид-ная ДНК трансформировала г+-штаммы с частотой, составляющей 10 или 0,2% от частоты трансформации г~-штамма [11— 13]. Тем не менее на практике многие эксперименты по молекулярному клонированию успешно проводятся именно на г+-штаммах В. subtilis. Система рестрикции этой бациллы активна также по отношению к фаговой ДНК, проникающей в клетку путем трансфекции, но не реагирует на хромосомную ДНК, введенную при трансформации [14].
