Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Векторы для грамотрицательных бактерий
209
Рис. 1. Функциональная и рестриктная карты плазмиды RSF1010. Сокращения: Sur—устойчивость к сульфонамидам; SmR — устойчивость к стрептомицину^ гер А, В и С — гены репликации; Mob — способность к мобилизации; Nic — точка релаксирующего одноцепочечного разрыва; Ori — область начала репликации.
генов. Желательно было ввести в нее еще несколько дополнительных уникальных сайтов. Четыре потенциально пригодных для клонирования рестрикционных сайта Bs?-EII, Ss?I,. EcoRI и Pstl (два сближенных участка) уже имелись в плазмиде. Однако для того, чтобы использовать три последние ре-стриктазы, необходимо было ввести в репликон RSF1010 дополнительный селективный маркер. Трудность заключалась в том, что гены устойчивости Su и Sm транскрибируются с одного и того же промотора [9, 11], поэтому введение фрагмента ДНК в сайт Pstl инактивировало оба гена и нарушало устойчивость как к Su, так и к Sm. Клонирование в Sst 1-сайте нарушало устойчивость к Sm. Хотя BcoRI-сайт расположен вне кодирующей последовательности гена Sm, при введении в него фрагмента ДНК устойчивость к Sm терялась, если только вставка не содержала собственного промотора, с которого этот ген мог бы транскрибироваться. Хотя при клонировании в сайтах ?coRI и SstI устойчивость к Su сохранялась, этот селективный маркер далеко не идеален. В настоящее время путем введения в репликон RSF1010 фрагментов ДНК, кодирующих гены устойчивости к антибиотикам, сконструированы плазмидные векторы, пригодные для клонирования с помощью-' различных рестриктаз.
14—196
Таблица 2. Векторы с широким спектром хоЗяей
рКТ231 RSF1010
рКТ212/214 RSF1010
РКТ262 PKT230
РКТ263 pKT231
рКТ240 RSF1010
рММВЗЗ/34 RSF1010
рММВ22 PKT240
рММВ24 PKT240
pGVl 106 Sa
pGVl 122 Sa
pSa4 Sa
pRK290 RK2
pRK2501 RK2
pRP301 RP4
pLAFRl pRK290
pME290 pVSI
Делеционный вариант РКТ231
ffindlll, Xhol, Xmal Ap
Clal Ap, Km
Sstl, ?coRI
BamHl, EcoRl Km
Sstl
^<m-.
?coRI Ap
tfmdlll Ap
?coRI Bglll, Km
BamHl, Pstl, Km, Sp
Sacll
tfmdlll, BamHl, Sail, Sp
Pstl Sp, Tc
Kpnl Sp, Cm
BamHl, Sstl Sp, Cm
Km
?coRI, Bglll Tc
Xhol, Hin&lll, Tc.
Sail, Km
EcoRl, Bglll Km, Tc
Bam HI, ?eoRI Ap, Tc
tfmdlll
jEcoRI Tc
Hindlll, Xhol, Xmal Cb
Pstl Km
Кт
Тс
Кт
сь
Амплифицируется [15] в присутствии Cm МоЬ+
Малокопийный [20]
МоЬ+
Малокопийный [20]
МоЬ+
Малокопийный [20]
Тга+
Космида МоЬ+ [28]
Не реплицируется [20]
в Е. coli
*). 2) Сокращения указаны в примечании к табл. 1,
а) ^ас-Промотор образован в результате слияния области —35 ^гр-промотора Е. coli и области —10 промотора /acUV5 Е. coli [32]
212
Глава 9
Hind III
Pst I-фрагмент pKTIOS
/ рАСУСПТ, линеаризованная PstI
- Pst I-фрагмент из pSa
Рис. 2. Векторы с широким спектром хозяев, полученные на основе RSF1010.
Схема конструирования трех из них — рКТ210, рКТ231 и рКТ230 — приведена на рис. 2. В табл. 2 перечислены свойства ряда векторов с широким спектром хозяев. Плазмида рКТ210 сконструирована путем введения фрагмента ДНК плазмиды Sa длиной 3,6 т. п. н., кодирующего устойчивость к хлорамфениколу (Cm), в сайт Pstl плазмиды RSF1010. Этот вектор можно использовать для клонирования в сайтах Ss/I, ?coRI и #mdIII. Рекомбинантные молекулы, несущие вставки в ?coRI- и Ss/I-сайтах, обнаруживаются по потере устойчивости к Sm, Плазмиды рКТ230 и рКТ231 имеют сходную структуру; рКТ230 представляет собой двойной репликон, полученный при лигировании линеаризованной Pstl плазмиды pACYC177 [12] с расщепленной Pstl RSF1010. Она кодирует устойчивость к Sm и канами-цину (Кт) и позволяет клонировать фрагменты, полученные
Векторы для грамотрицательных бактерий
213
при помощи tfmdlll, XhoI, Xmal, BstEll, BamWl, ?coRI и SstI. Вектор pKT231 также кодирует устойчивость к Sm и Кт (соответствующие гены локализованы в Ps^I-фрагменте длиной 4,6 т. п. н., полученном из R6-5 миниплазмиды рКТ105 и введенном в RSF1010). В этой плазмиде можно клонировать фрагменты ?coRI, SsH, #wdIII, Xhol, Xmal, Clal. Число копий на эквивалент генома для всех векторов, полученных на основе репликона RSF1010, составляет 15—20.
Имеются векторы, полученные путем введения в репликон RSF1010 в качестве селективного маркера гена устойчивости к тетрациклину (Тс). Хотя плазмиды рКТ212 и рКТ214 включены в табл. 1, следует отметить, что они имеют ограниченное применение для Pseudomonas и, вероятно, для других грамотрицательных бактерий. Эти плазмиды нестабильны, особенно в бактериальных культурах, выращенных в отсутствие антибиотиков, видимо, вследствие того, что мембранный белок, обусловливающий устойчивость к тетрациклину, неблагоприятно влияет на жизнеспособность хозяина [13].
