Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
вводимых в jEcoRI-сайт.
анализа регуляции генов прокариот [25, 26]. Векторы, предназначенные для идентификации промоторов Е. coli, основаны на хорошо охарактеризованных генах, продукты которых можно легко обнаружить и оценить их количество, например гене га-лактокиназы [25] и галактозидазы [36]. Если содержащий промотор фрагмент ДНК клонирован перед началом от этого гена, в клетке появится продукт его экспрессии.
Недавно описан вектор с широким спектром хозяев, пригодный для идентификации промоторов этим способом [32]. Плазмида рКТ240 (рис. 5) была сконструирована путем замены 1,3 т.п.н. фрагмента BstEll/EcoRl плазмиды RSF1010 на BstfEII/iiCoRI-фрагмент pHSG 415 длиной 3,9 т.п.н. [37]. Этот фрагмент кодирует устойчивость к Ар и Кт. В результате замены из последовательности RSF1010 делегируются промотор гена устойчивости к Su/Srn и кодирующая последовательность гена устойчивости к Sm. Включение фрагментов ДНК, кодирующих промоторные последовательности, в EcoRl-c&m рКТ240 восстанавливает устойчивость к Sm ([32] и Франклин, неопубликованные данные), что позволяет легко обнаружить активность промотора по фенотипу.
Плазмиду можно использовать для скрининга фрагментов, кодирующих предполагаемые промоторы, либо для поиска промоторов в тотальной ДНК.
1. Полностью расщепите ДНК рКТ240 ?coRI в 50 мкл 50 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl.
2. Инактивируйте рестриктазу 5 мин при 70 °С. Осадите ДНК, добавив 3 М ацетат натрия до конечной концентрации
0,3 М и один объем изопропанола, охлажденного до —20 °С.
15—196
226
Глава 9
Выдержите 20 мин при —70 °С. Соберите выпавшую в осадок ДНК в микроцентрифуге. Осторожно удалите надосадок, промойте осадок ДНК 70%-ным этанолом и высушите в вакуумном эксикаторе.
3. Растворите осадок ДНК в 50 мкл буфера для фосфатазы
(50 мМ трис-НС1 pH 9,0; 1 мМ MgCl2, 100 мкМ ZnCl2; 1 мМ спермидина). Проинкубируйте 30 мин при 37 °С с двумя единицами фосфатазы из кишечника теленка. Это необходимо для удаления 5'-фосфатных групп и предотвращения циклизации вектора при лигировании [19]. Остановите реакцию двухкратной экстракцией равным объемом фенола. Для удаления остатков фенола водную фазу проэкстрагируйте 5 раз эфиром. Осадите ДНК так же, как на стадии 2, и растворите в 20 мкл буфера для лигирования (50 мМ трис-НС1 pH 7,5; 10 мМ
MgCl2, 2 мМ АТР; 5 мМ ДТТ).
4. Расщепите 5 мкг предназначенной для скрининга ДНК •EcoRI, как описано на стадии 1. Обработайте далее согласно процедурам стадий 2 и 3. Остановите реакцию, осадите ДНК и растворите ее в 80 мкл буфера для лигирования. Смешайте с векторной ДНК, добавьте 0,25 ед ДНК-лигазы фага Т4 и проинкубируйте ночь при 15 °С.
5. Лигированной ДНК трансформируйте Е. coli по методике, описанной в гл. 6. На данном этапе можно выбрать один из вариантов — либо трансформировать Е. coli для скрининга промоторной активности в этом хозяине, либо (имея в виду нередко плохую экспрессию в Е. coli генов неродственных бактерий) выбрать штамм, несущий соответствующую плазмиду-помощник (описано в разд. 3.4.1). В дальнейшем это позволит провести скрининг в естественном хозяине гена.
6. В первом случае рассейте трансформированные клетки на чашках с L-агаром, содержащим Sm в диапазоне концентраций 20—200 мкг/мл. Во втором случае необходимо перенести рекомбинантные плазмиды в хозяина, из которого взяты предполагаемые промоторные последовательности. Если необходимо проверить какой-либо определенный фрагмент, мобилизацию можно провести после того, как будет идентифицирован соответствующий рекомбинантный клон. Если осуществляют поиск в тотальной ДНК, мобилизацию можно провести перед рассевом трансформированных клеток. Выдержав клетки некоторое время (60—90 мин) для экспрессии, смешайте 1 мл суспензии трансформированных клеток с 0,2 мл культуры бактерий-реципиентов, находящейся на поздней логарифмической стадии роста. Нанесите аликвоты по 25 мкл на фильтры и продолжайте далее так, как описано в разд. 3.4. Затем рассейте клетки на L-arape, содержащем 20—200 мкг/мл стрептомицина и антибиотик, нужный для подавления роста донора. Проинкубируйте в течение ночи.
Векторы для грамотрицательных бактерий
227
7. При отсутствии вставки, несущей промотор, вектор рКТ240 придает хозяину устойчивость к 20 мкг/мл стрептомицина (для Е. coli) и к 50 мкг/мл (для P. putida). Отберите колонии, растущие при более высоких концентрациях стрептомицина, и рассейте их заново для очистки и проверки на устойчивость.
8. Выделите ДНК и охарактеризуйте фрагмент-вставку. Правильно оценить активность промотора можно, определив активность стрептомицинфосфотрансферазы [32].
4.5. Векторы на основе RSF1010, удовлетворяющие требованиям биологической безопасности
Некоторые эксперименты по клонированию попадают под действие правил, регламентирующих работы с рекомбинантными ДНК, и должны выполняться только с использованием определенных систем вектор-хозяин. Одно из основных правил состоит в том, что применяемый вектор должен быть нетранс-миссибельным й не должен переноситься совместно с конъюга-тивной плазмидой путем мобилизации. На основе RSF1010 сконструировано несколько отвечающих этим требованиям плазмид [9]. Для этого была выделена производная от RSF1010 плазмида, содержащая в локусе mob элемент ТпЗ. Затем эта плазмида была линеаризована BamHl (BamHI-сайт расположен в элементе ТпЗ). После обработки нуклеазой Ва/31 из нее была получена плазмида рКТ261. Из этой плазмиды область mob и элемент ТпЗ были полностью удалены. В дальнейшем были сконструированы аналогичные рКТ230 и рКТ231 дефектные по мобилизации векторы, обозначенные рКТ262 и рКТ263 (табл. 2). Табл. 7 иллюстрирует влияние делеции части репликона RSF1010 на способность RP4 мобилизовать эти
