Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Итак, оценить, какая из процедур трансфекции предпочтительнее для данной линии клеток, можно, определяя энзиматическую активность маркерного белка после трансфекции или же подсчитывая долю трансформированных клеток в популяции. Следующая задача — выбрать наиболее подходящую для конкретных условий векторную систему. Целесообразно опробовать несколько разных векторов в сочетании с различными вариантами основной методики трансфекции. Время, затраченное на этом этапе на тщательный анализ и оптимизацию экспериментальных условий, сохранит в будущем гораздо больше времени и сил при проведении продолжительных и трудоемких экспериментов.
8. Стабильная экспрессия
В этом разделе мы рассмотрим несколько методик селекции. Это тимидинкиназная селекция, основанная на экспрессии экзогенного гена тимидинкиназы (tk) в мутантных клетках, утративших эндогенную активность, а также две наиболее широко распространенные методики, основанные на экспрессии доми-
432 Глава 6
Рис. 5. Флуоресцентное окрашивание клеток. С помощью кальций-фосфатного метода проводили трансформацию клеток CV-1 плазмидой pRSVcat; клетки обрабатывали бутиратом, инкубировали с поликлональными антителами к CAT, а затем со вторыми антителами, конъюгированными с родамином.
нантных селективных маркеров — генов Е. coli gpt и пеоR. Использование доминантного маркера подразумевает, что реци-пиентные клетки необязательно должны быть генетически маркированы, поэтому две последние системы отличаются универсальностью. Описанные выше эксперименты по временной экспрессии могут дать ответ на вопрос, какой контролирующий элемент стоит ввести в состав вектора для экспрессии в данном типе клеток. В общем виде стабильная трансформация предполагает субкультивирование клеток в селективной среде через два дня после трансфекции. Клетки высевают на подходящую селективную среду при плотности 5 • 104 клеток на 10-см чашку.
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
433
Среду меняют раз в 4—5 дней, пока клетки на контрольной чашке (в которые не была введена ДНК) не погибнут в селективных условиях. На экспериментальных чашках (трансформированные клетки) появляются отдельные устойчивые колонии.
8.1. Тимидинкиназная селекция
Эту методику можно использовать только для клеток, де-фектных по экспрессии тимидинкиназы (ТК) [22]. Такие мутантные клетки, помещенные на специальную селективную среду, погибают. У них отсутствует функционально-активный фермент ТК, катализирующий превращение тимидина в инозинмо-нофосфат (IMP); селективная же среда содержит аминоптерин, ингибирующий превращение в IMP других предшественников. Ген tk в составе плазмиды спасает эти клетки от гибели, реализуя для них тимидиновый путь получения IMP. Таким образом, на среде с аминоптерином, содержащей также тимидин и гипоксантин, выживают только те мутантные клетки, которые экспрессируют экзогенную ТК- Селективную среду часто называют НАТ-средой. Она содержит 10~4 М гипоксантин, 2-10~5 М аминоптерин и 10-4 М тимидин. Ниже указаны концентрированные растворы, которые легко разводятся до нужной концентрации при добавлении к DMEM.
1) 10-2 М раствор гипоксантина разводится в 100 раз.
2) 10~3 М раствор аминоптерина разводится в 50 раз.
3) 0,04 М раствор тимидина разводится в 400 раз.
Поскольку тимидинкиназная селекция возможна только при
использовании мутантных клеток, исследователь оказывается здесь «привязанным» к тому типу реципиентных клеток, который находится в его распоряжении. Чаще всего это мышиные ^“-клетки. В этом смысле описанные ниже две другие методики, основанные на использовании доминантных селективных маркеров, представляются более универсальными.
8.2. Селекция по GPT
По своей сути доминантная селекция с использованием гена gpt, основанная на экспрессии бактериального фермента гипо-ксантин-фосфорибозилтрансферазы [23J, является вариантом тимидинкиназной селекции. Здесь также блокируются аминоптерином метаболические пути, приводящие к IMP. Микофено-ловая кислота — ингибитор IMP-дегидрогеназы блокирует образование гуанозинмонофосфата. Присутствие в среде этих двух ингибиторов делает недостаточным добавление одного только
2Я—IQfi
434
Глава 6
гипоксантина. Обходной путь можно реализовать лишь при одновременном добавлении гуанина и гипоксантина. Если же клетки способны превращать ксантин в гуанин, достаточно присутствие его в среде вместо гуанина. На этом и основана GPT-селекция. Клетки млекопитающих не располагают ферментами, способными осуществлять такое превращение. Поэтому на селективной среде, содержащей ксантин, выживают только те клетки, которые экспрессируют бактериальный ген gpt. Продукт этого гена катализирует превращение экзогенного ксантина в гуанин. Векторы-прототипы для такой селекции — pSV2gpt [18] и pRSVgpt [4]. Метод хорошо работает на клетках NIH3T3, клетках крысы, клетках почки обезьяны CV1 и клетках СНО. Приготовление селективной среды описано в табл. 4.
