Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 194

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 188 189 190 191 192 193 < 194 > 195 196 197 198 199 200 .. 253 >> Следующая

1. Для определения ^-галактозидазы клетки лизируют в
0,25 М трис-НС1 pH 7,8; 5 мМ дитиотрейтоле.
2. Готовят реакционную смесь следующего состава:
10—150 мкл клеточного лизата
1 мкл раствора: 60 мМ ЫагНР04; 40 мМ NaH2P04; 10 мМ КС1; 1 мМ MgCl2; 50 мМ [З-меркаптоэтанол
0,2 мл раствора: ONPG (о-нитрофенил-^-О-галактопи-
ранозид) 2 мг/мл в 60 мМ Na2HP04; 40 мМ NaH2P04
3. Инкубируют пробу при 37 °С до появления желтой окраски.
4. Останавливают реакцию, добавляя 0,5 мл 1 М ЫагСОз, и оценивают интенсивность окрашивания спектрофотометрически при 420 нм.
Следует помнить, что клетки млекопитающих содержат эукариотический изозим fi-галактозидазы. Поэтому в качестве контроля необходимо включить в эксперимент лизат, полученный из интактных клеток.
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих 429
7.3. Определение эффективности трансфекции по реакции
с антителами
Итак, эффективность трансфекции можно оценить, определяя косвенным образом транскрипционную активность маркерного гена. В дополнение к этому можно определить реальное число клеток, экспрессирующих чужеродную ДНК по реакции с антителами к кодируемому плазмидой антигену.
Этот методический прием, хотя и не позволяет количественно оценивать эффект, обеспечивает большую свободу действий, поскольку в качестве маркера трансфекции здесь можно использовать любой белок, который в норме не экспрессируется в реципиентной клетке (конечно, при условии, что имеются в распоряжении соответствующие антитела). Помимо двух бактериальных генов, о которых мы уже рассказали, широко используются такие маркеры, как fl-глобин и различные вирусные антигены. Метод иммунодетекции, основанный на использовании антител, конъюгированных с пероксидазой, оказался более простым в постановке и в то же время более чувствительным, чем реакции с флуоресцентными антителами. Ниже мы приводим описание соответствующей экспериментальной процедуры, которая, однако, при желании может быть адаптирована для «флуоресцентной» методики.
Непрямое иммунологическое выявление трансформированных клеток проводят следующим образом:
1. Клетки можно выращивать на чашках любого размера, однако наиболее удобны 35-мм чашки или 6-луночные планшеты.
2. Зафиксируйте клетки свежеприготовленной смесью равных объемов метанола и ацетона (инкубация 2 мин) и промойте PBS.
3. Определите требуемое разведение антител. Для этого придется построить калибровочную кривую. В большинстве случаев надосадочную жидкость из гибридомной культуры используют неразведенной или разводят в 10 раз. Для асцитных жидкостей фактор разведения обычно составляет от 100 до 5000. Разведения антител на этой и всех последующих стадиях приготавливают в растворе, содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки и 1 % бычьего сывороточного альбумина в стерильном PBS.
4. На 35-мм чашку налейте 1 мл раствора первых антител и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2—3 ч.
5. Удалите раствор антител и промойте клетки в четырех сменах PBS.
6. Залейте клетки раствором антител, конъюгированных с пероксидазой. Вероятно, здесь также придется предварительно провести калибровку, чтобы определить нужное разведение вто-
Рис. 4. Окрашивание клеток пероксидазой. С помощью кальций-фосфатпого метода проводили трансформацию клеток CV-1 плазмидой pSV2cat; клетки инкубировали с моноклональными антителами к CAT, а затем — со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой.
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
431
рь\х антител. Ожидаемый фактор разведения — от 50 до 1000. Продолжительность инкубации со вторыми антителами может варьировать от 1 ч при комнатной температуре до 16 ч при 4°С.
7. Удалите раствор антител и промойте клетки, как описано в п. 5.
8. Теперь добавьте субстрат для пероксидазы. Наилучшие результаты были достигнуты с О-дианзидином (Sigma), который дает очень низкий фон. Чтобы приготовить субстратный раствор, сначала растворите О-дианзидин в абсолютном этаноле до насыщения. После того как раствор отстоится, добавьте 1 мл его к 99 мл PBS и затем туда же внесите 10 мкл перекиси водорода (разведение 1:10 000). Небольшое количество субстрата (1 мл) можно проверить, смешав его с 1 мкл конъюгата антител с пероксидазой: должна появиться темная коричневопурпурная окраска. Добавьте субстратный раствор к клеткам и выдержите 1 ч при комнатной температуре, чтобы цветная реакция прошла достаточно полно. Тщательно промойте чашку дистиллированной водой и поместите под покровное стекло. Препарат имеет устойчивую окраску (рис. 4).
Для получения флуоресцентно окрашенных препаратов пункты 1—5 описанной выше методики выполняют без изменений. Затем вместо меченных пероксидазой антител добавляют флуоресцентно меченные вторые антитела. Напомним, что эта методика требует наличия флуоресцентного микроскопа. Кроме того, флуоресцентные препараты недолговечны, так как флуоресценция быстро затухает. В целом же данный метод дает вполне удовлетворительные результаты (рис. 5).
Предыдущая << 1 .. 188 189 190 191 192 193 < 194 > 195 196 197 198 199 200 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed