Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
7.1. Тест-системы с хлорамфеникол-ацетилтрансферазой
Этот ген кодирует устойчивость бактерий к хлорамфениколу. Он достаточно хорошо изучен; разработаны высокочувствительные методы определения соответствующей ферментативной активности. Поскольку кодирующая область гена невелика (700 пар нуклеотидов), несущие этот ген векторы легко могут быть модифицированы. Экспрессия бактериального гена CAT в клетках млекопитающих может служить тестом на активность промоторов в эукариотических векторах [20]. В векторах-прототипах pSV2cat [20] (рис. 1) и pRSVcat [3] (рис. 2) для осуществления транскрипции бактериального гена используются соответственно промотор SV40 и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.
Процедура определения энзиматической активности CAT основана на использовании радиоактивного субстрата-— [14С]хлор-амфеникола и включает анализ ацетилированных продуктов реакции с помощью тонкослойной хроматографии (методика описана в табл. 3). Контрольный препарат CAT производит фирма PL Biochemicals. Кинетика реакции проиллюстрирована на рис. 3.
7.2. Определение fi-галактозидазы
Кодирующая область бактериального гена р-галактозидазы также широко используется для маркирования векторов, предназначенных для временной экспрессии [21]. Конструирование
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
Таблица 3. Определение хлорамфеникол-ацетилтрансферазы
1. После трансфекции клеток одним из описанных выше методов клетки промойте PBS, соберите и перенесите в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
2. К осадку клеток добавьте 100 мкл 0,25 М трис-НС1 pH 7,8.
3. Лизируйте клетки замораживанием — оттаиванием. Для этого пробирку с клетками погружают на 5 мин в спиртовую баню с сухим льдом и затем переносят на водяную баню, имеющую температуру 37 °С. Цикл повторяют три раза.
4. Отцентрифугируйте, чтобы удалить остатки клеток; надосадочную жидкость сохраните для определения ферментативной активности. На этой стадии пробы можно хранить в замороженном состоянии при —20 °С.
5. В зависимости от типа клеток и тестируемого промотора количество экстракта, взятого в реакцию, может варьировать. Реакционная смесь содержит:
70 мкл 0,25 М трис-НС1 pH 7,8
35 мкл воды
20 мкл клеточного экстракта
I мкКи [14С] хлорамфеникола (40—50 Ки/Ммоль) (NEN или Amer-
sham)
20 мкл 4 мМ ацетил-СоА1)
6. Инкубируйте смесь при 37 °С в течение 10—30 мин. Время инкубации можно увеличить до 60 мин, если обеспечить реакцию достаточным для сохранения линейной кинетики количеством активного ацетил-СоА2).
7. Экстрагируйте хлорамфеникол 1 мл этилацетата при интенсивном встряхивании в течение 30 с.
8. Открутите пробу на микроцентрифуге и отберите верхнюю органическую фазу, содержащую все формы хлорамфеникола (два моноацетата, диацетат и исходный хлорамфеникол, рис. 3).
9. Удалите этилацетат сушкой в вакууме. На это потребуется около 2 ч.
10. Ресуспендируйте высушенные продукты в 20 мкл этилацетата3> и нанесите на пластинки с силикагелем для ТСХ (такие пластинки производят, например, фирмы Baker или Merck).
11. Образцы хроматографируют4) в системе хлороформ : метанол (95:5).
12. Пластинки высушивают на воздухе и экспонируют с рентгеновской пленкой в течение ночи. Относительное количество хлорамфеникола, переведенного в форму моноацетата, служит оценкой транскрипционной активности гена CAT и, следовательно, оценкой эффективности трансфекции.
') 4 мМ раствор ацетил-СоА готовят, растворяя 1,5 мг сухого вещества в 0,5 мл воды.
2) Ацетил-СоА очень нестабильное вещество; можно использовать только свежеприготовленный раствор или раствор, который хранился замороженным при —20 °С не более 10 дней.
3) Этилацетат следует отбирать только стеклянной пипеткой.
4) Хроматографическую камеру следует выстлать изнутри фильтровальной бумагой, чтобы уравновесить систему. Используйте только свежеприготовленный растворитель, так как хлороформ очень летуч.
векторов, содержащих этот ген,— занятие несколько более трудоемкое, чем в случае CAT-содержащих систем, ввиду гораздо большего размера кодирующего участка. В то же время чувствительность метода определения ^-галактозидазы ниже, чем чувствительность CAT-теста. Определение {5-галактозидазы служит хорошим контролем на компетентность клеток. Оба фер-
428
Глава 6
Определение CAT-активности в экстракте из 5хЮ6клеток
ft
* М Т*?
ill 1 « 1
СМ 30 20 10 5 1
Время, мин
Рис. 3. Определение CAT-активности. Показана динамика накопления ацети-лированных форм хлорамфеникола (СМ) во времени. Тестируемые экстракты получены из клеток CV-1, трансформированных pRSVcat. Для описанного метода требуется всего лишь 1/20 часть экстракта, полученного с 9-см чашки; метод очень чувствителен и позволяет выявить менее 1 пкг функционального
фермента.
мента — CAT и ^-галактозидазу — можно определять в одном и том же клеточном экстракте.
