Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 197

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 191 192 193 194 195 196 < 197 > 198 199 200 201 202 203 .. 253 >> Следующая

Если этот ген не кодирует селективный фенотип, целесообразно использовать методику котрансфекции [26]. Котранс-фекция предполагает использование селективного плазмидного
Таблица 5. Получение клеточной ДНК для трансфекции
1. Приготовьте достаточное число чашек, чтобы получить приблизительно 108 клеток. Ориентировочно это четыре 75 см2 флакона или восемь 130 мм чашек.
2. Промойте клетки PBS три раза.
3. Добавьте к клеткам 5 мл раствора протеиназы К4). Объедините клетки с чашек или флаконов и поместите их в пробирку на 50 мл. Инкубируйте при 47 “С в течение 6 ч.
4. Экстрагируйте раствор дважды 10 мл фенола. Используйте только свежеперегнанный фенол, забуференный 50 мл трис-НС! pH 7,5.
5. Диализуйте водную фазу против 4 л TEN2> в течение 24 ч. Диализ надо поставить таким образом, чтобы объем диализуемого раствора увеличился в три раза. Повторите эту процедуру.
6. Подготовьте раствор ДНК к центрифугированию в градиенте плотности CsCl: добавьте CsCl из расчета 1,058 г на 1 мл раствора ДНК и, кроме того, 0,84 мл раствора этидиумбромида (10 мг/мл).
7. Центрифугируйте при 34 000 об/мин в течение 72 ч в роторе Ti60 или в течение 24 ч в роторе VTi50.
8. Отберите полосу, соответствующую клеточной ДНК, руководствуясь рекомендациями, изложенными в разд. 3.2. Следует, однако, по возможности увеличить диаметр иглы для шприца, например, взять иглу № 16, чтобы избежать фрагментирования ДНК- Приготовьте ДНК для преципитации, как это описано в разд. 3.
¦) 5 мг протеиназы К растворяют в смеси 23,8 мл ЭДТА pH 8,0 и 1,25 мл 10%-ного саркозила.
2) TEN: 5 мМ трис-НС! pH 7,5; 2,5 мМ ЭДТА; 20 мМ NaCl.
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
437
маркера в дополнение к донорной ДНК, что позволяет отбирать клетки с интегрированной донорной ДНК по экспрессии маркерной плазмиды. Затем отобранные клоны скринируют на функциональную активность интересующего гена. Эффективность трансфекции для плазмидного вектора может быть довольно высокой (Ю-1), что увеличивает шансы обнаружить в одном из клонов также и специфический клеточный ген. Таким образом, оба описанных подхода можно объединить: сначала отбирать по рлазмидному маркеру клоны клеток, экспрессирующих просто чужеродную ДНК, а затем проводить селекцию по экспрессии специфического фенотипа. Эксперименты по котранс-фекции показали, что около 25% клонов содержат как плазмид-ный вектор, так и геномную ДНК [24].
Методики прямого геномного переноса не отличаются от процедур, описанных для плазмидных векторов. Качество ДНК и в этом случае остается весьма важным параметром, влияющим на эффективность трансфекции. На наш взгляд, необходимым требованиям отвечают препараты высокомолекулярной геномной ДНК, полученные по методике, описанной в табл. 5.
Литература
1. Khoury G„ Gruss P. Cell, 33, 313 (1983).
2. Laimons L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6453 (1982).
3. Gorman C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777 (1982).
4. Gorman C., Padmanabhan R., Howard B. Science, 221, 551 (1983).
5. Pelham H„ Bienz Al. EMBO J„ 1, 1473 (1982).
6. Mayo K., Warren R., Palmiter R. Cell, 29, 99 (1982).
7. Hamer D., Walling M. I. J. Mol. Appl. Genet., 1, 273 (1982).
8. Karin М., Richards R. Nature, 299, 797 (1982).
9. Robins D. et al. Cell, 29, 623 (1982).
10. Lee F. et al. Nature, 294, 228 (1981).
11. Graham F., van der Eb A. Virology, 52, 456 (1973).
12. Gorman C., Howard B., Reeves R. Nucleic Acids Res., 11, 7631 (1983).
13. Luthman H., Magnusson G. Nucleic Acids Res., 11, 1295 (1983).
14. Sompayrac L., Danna K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 12, 7575 (1981).
15. Banerji J., Olson L., Schafftier W. Cell, 33, 729 (1983).
16. Lopata М., Cleveland D., Sollinar-Webb B. Nucleic Acids Res., 12, 5707
(1984).
17. Schumperli D., Howard B., Rosenberg M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 257 (1982).
18. Mulligan R„ Berg P. Science, 209, 1422 (1980).
19. Scholer H., Gruss P. Cell, 36, 403 (1984).
20. Gorman C„ Moffat L., Howard B. Mol. Cell Biol., 2, 1044 (1982).
21. Halt C. et al. J. Mol. Appl. Genet., 2, 101 (1983).
22. Wigler M. et al. Cell, 11, 223 (1977).
23. Mulligan R., Berg P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981).
24. Southern P., Berg P. J. Mol. Appl. Genet., 1, 327 (1982).
25. Wigler M. et al. Cell, 16, 777 (1979).
26. Lowy 1. et al. Cell, 22, 817 (1980).
27. Queen C„ Korn L, Methods in Enzymology, 65 (1979), ______
Приложение 1
Нуклеотидная последовательность pSV2 cat
10 __________20 _______ 30
CTTTTTGCAA AAGCCT AGGC СТССААААЛА
70 80 90
GG.CCGAGGCG GCCTCGGCCT CTGCATAAAT
1 30 1 40 1 50
Предыдущая << 1 .. 191 192 193 194 195 196 < 197 > 198 199 200 201 202 203 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed