Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 196

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 190 191 192 193 194 195 < 196 > 197 198 199 200 201 202 .. 253 >> Следующая

Таблица 4. Среда для gpt-селекции
Л. Растворы
1. Ксантин растворяют в 0,1 М NaOH в концентрации 5 мг/мл; pH раствора доводят до 10,5 НС1, стерилизуют раствор фильтрованием и хранят при ко.мнатной температуре.
2. Раствор гипоксантина готовят следующим образом. 136 мг гипоксантина растворяют в 80 мл воды; добавляют 5 мл 0,1 М NaOH, pH раствора доводят до 9,5, добавляют воды до 100 мл; стерилизуют фильтрованием и хранят при комнатной температуре. Гипоксантин растворяется с трудом, поэтому первые 10—15 мин рекомендуется помешивать раствор.
3. Тимидин растворяют в воде в концентрации 59 мкг/100 мл; раствор стерилизуют фильтрованием и хранят при 4 °С.
4. Глицин растворяют в воде в концентрации 500 мг/100 мл; раствор стерилизуют фильтрованием и хранят при 4 °С.
5. Аминоптерин. 8,8 мг аминоптерина растворяют в 10 мл PBS, стерилизуют раствор фильтрованием и хранят замороженными порциями по 1 мл; раствор следует защищать от света.
6. Микофеноловая кислота. Получена от Eli Lilly по спецзаказу. Приготавливают раствор с концентрацией 25 мг/мл в абсолютном спирте (используйте стеклянную посуду).
7. Диализованная сыворотка. Диализуют 100 мл фетальной телячьей сыворотки против 2 л 0,9%-ного NaCl при 4 °С в течение 2 сут. Диализный раствор меняют и снова диализуют в течение 2 сут. Цикл повторяют еще дважды и стерилизуют сыворотку фильтрованием под давлением.
Б. Селективная среда
Среду готовят непосредственно перед использованием из описанных выше запасных растворов.
Для приготовления 100 мл среды следует взять:
DMEM (с антибиотиками, см. разд. 4) 80 мл
Диализованную сыворотку 10 мл
Раствор ксантина 5 мл
Глицин 0,2 мл
Гипоксантин 1 мл
Тимидин 2 мл
Аминоптерин 0,225 мл
Микофеноловую кислоту 0,1 мл
\
________Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих 435
8.3. Селекция по устойчивости к неомицину
Метод предполагает отбор клеток, приобретающих устойчивость к антибиотику. Неомицин — это бактериальный антибиотик, инактивирующий прокариотические рибосомы. Клетки млекопитающих невосприимчивы к неомицину или канамицину, однако известны аналоги этих агентов, которые подавляют деятельность эукариотических рибосом, один из таких препаратов, G418, выпускается фирмой Gibco под торговым названием Gene-ticin. Ген neoR кодирует фосфотрансферазу, которая инактивирует G418. Следовательно, клетки, экспрессирующие этот бактериальный маркер лекарственной устойчивости под контролем эукариотического промотора, сохраняют жизнеспособность на селективной среде. Неомициновую селекцию можно проводить практически на любом типе клеток; векторы-прототипы — pSV2neo [24], pRSVneo [4].
Geneticin (Gibco) добавляют в культуральную среду в концентрации, подобранной эмпирически. Необходимо провести титрование, чтобы определить количество препарата, вызывающее гибель нетрансформированных клеток. Препарат хранят в виде раствора в концентрации 100 мг/мл. Опробуйте рабочие концентрации в интервале от 200 мкг/мл до 1 мг/мл. Селекция может оказаться «смазанной», если в среде слишком мало антибиотика или же если клетки были высеяны при слишком высокой плотности. В идеале контрольные клетки погибают в течение недели, а устойчивые колонии формируются через 10—14 дней.
9. Прямой перенос хромосомных генов
В настоящей главе мы сосредоточили внимание на экспериментах по генетическому переносу с использованием плазмид-ных векторов.
В частности, были освещены вопросы, связанные с применением этих векторов при подборе оптимальной методики трансфекции для конкретного типа клеток в экспериментах, направленных на изучение закономерностей экспрессии генов. Между тем в тени остался еще один аспект проблемы генетического переноса, а именно непосредственный перенос хромосомных генов из одной клетки в другую. Число реципиентных клеток, в геном которых интегрировалась донорная клеточная ДНК, очень невелико. Поэтому необходимо иметь в распоряжении методику, которая обеспечила бы селекцию этих клеток. Для выделения клонов клеток, акцептировавших чужеродную клеточную ДНК, используют два методических подхода. Первый основан на селекции конкретного фенотипа, определяемого перенесенным геном. Для подобного эксперимента необходимы реципиентные клетки,
28*
436
Глава 6
не экспрессирующие функциональную активность, определяемую донорной ДНК. Примером такого рода эксперимента может служить работа Лови с сотр. [26]. Эти авторы в качестве реци-пиентных использовали клетки мутантов, утративших аденин-фосфорибозилтрансферазную активность (APRT). Донорной ДНК служила клеточная ДНК из нормальных клеток. Клоны отбирали по способности расти на НАТ-среде. На этой среде выживают только те клетки, которые имеют функционально активный ген aprt. Следовательно, отобранные клоны клеток приобретали данный ген из пула генов донорной клеточной ДНК-Эффективность трансфекции составляла 10-4. Это означает, что из каждых 10 ООО клеток, приведенных в контакт с донорной ДНК, только одна клетка приобретала ген aprt и оказывалась жизнеспособной в условиях проводимой селекции. Ограничением метода следует считать то, что клонируемый ген обязательно должен экспрессировать некий примечательный фенотип, для которого можно было бы подобрать соответствующие условия селекции. Кроме того, необходимо иметь реципиентные клетки, не экспрессирующие функциональную активность, определяемую интересующим геном.
Предыдущая << 1 .. 190 191 192 193 194 195 < 196 > 197 198 199 200 201 202 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed