Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Важное значение имеет также плотность исследуемого раствора. Она должна быть равдой или по крайней мере близкой к плотности среды в месте его введения. В связи с тем что измерение плотностей жидкостей в малых объемах является трудоемкой процедурой, для создания условий, при которых исследуемый раствор и среда будут иметь одинаковую плотность,, применяются более простые методы. Свенссон и др. [1265] предложили в месте введения пробы создавать «уступ плотности» — крутой локальный градиент плотности. В этом случае достигается хорошее приближение к идеальной плотности пробы, так как она может быть любой в пределах плотностей верхнего и нижнего краев «уступа». Обычно формирование слоя исследуемой пробы проходит успешно, если градиент плотности в месте ее внесения настолько крут, что расстояние между этим местом и слоем, имеющим одинаковую с пробой плотность, не превышает нескольких миллиметров. В этом случае раствор пробы почти ламинарно перемещается вверх или вниз: до уровня равной с ним плотности и образует тонкую горизонтальную полосу. Если же градиент плотности слишком пологий и (или) расстояние между местом внесения пробы и слоем с равной плотностью велико, то перемещение пробы вплоть до* достижения ею этого слоя будет сопровождаться конвекционными токами, ухудшающими качество стартовой зоны. Поскольку при электрофорезе в градиенте -плотности в отличие от изоэлектрического фокусирования толщина стартовой зоны существенно влияет на качество разделения, правильное внесение пробы имеет исключительно важное значение.
Сам по себе исследуемый раствор непосредственно после его внесения в колонку еще не стабилизирован, так как в нем отсутствует градиент плотности, который позднее формируется в результате диффузии сахарозы. Чтобы процесс стабилизации
мог осуществиться, рекомендуется после внесения пробы включать напряжение не сразу, а спустя определенное время, которое зависит от толщины слоя внесенной пробы. Если она составляет 5 мм, то достаточно подождать 15 мин [1259].
Необходимо отметить, что гравитационная стабильность зо-*ны в момент ее внесения еще не означает, что она будет сохраняться и дальше. Часто слой исследуемой пробы (несмотря на то что ее плотность была тщательно подогнана) обнаруживает тенденцию *к образованию мелких капелек, которые оседают все глубже и глубже в колонку и могут полностью разрушить -стартовую зону. Причина этого явления заключается в возникновении отрицательного градиента плотности из-за того, что сахароза диффундирует в начальную зону быстрее, чем из нее диффундируют белки [162].
Свенссон и др. [1265] предложили для преодоления этой трудности дополнительно растворять в пробе вспомогательные вещества (декстран, глицерин, иодистый калий), которые будут диффундировать из нее быстрее, чем белки, и таким образом противодействовать обратной диффузии сахарозы.
Создание крутого градиента плотности ниже слоя разделяемых макромолекул также препятствует образованию капелек.
В принципе исследуемый раствор можно внести в любом месте в пределах градиента плотности. Однако если заряды разделяемых белков имеют один и тот же знак, то их омесь лучше помещать в самой нижней или самой 'верхней части градиентной колонки. Если же в пробе присутствуют как положительно, так и отрицательно заряженные компоненты, то образец лучше расположить где-нибудь в середине колонки.
Поскольку скорость перемещения заряженных белков в электрическом поле зависит от фактической вязкости раствора, их движение будет ускоряться при восходящем и замедляться при нисходящем электрофорезе [1214]. Это необходимо учитывать при планировании экспериментов. Например, если относительные электрофоретические подвижности разделяемых компонентов при данном pH относятся как 1 :4 : 5, то восходящий электрофорез даст лучшие результаты. Для смеси белков с отношением относительных подвижностей 1 : 2 : 3 : 4 разделение будет плохим как при восходящем, так и при нисходящем ¦электрофорезе. В этом случае подвижности следует увеличивать или путем применения соли, создавая тем самым градиент электропроводности, или с помощью градиента pH (изо-электрическое фокусирование). Можно также проводить электрофорез в среде, действующей как молекулярное сито (гели), чтобы фракционировать вещества не только по заряду, но и по размерам молекул.
ПОЛУЧЕНИЕ ГРАДИЕНТОВ ПЛОТНОСТИ
Обычно применяют линейные градиенты плотности, однако в некоторых случаях в верхней части колонки целесообразно создавать также и более крутые нелинейные градиенты. Практически можно воспользоваться любым методом, предложенным для получения градиентов плотности. Наиболее простая методика, не требующая никаких специальных приборов, заключается в последовательном наслаивании нескольких растворов в порядке убывания их плотности. Неоднородности на границах примыкающих зон позднее сглаживаются благодаря диффузии. Однако в настоящее время большинство исследователей работают с градиентными смесителями разных типов, используемыми для создания градиентов концентрации растворов при хроматографии, центрифугировании в градиенте плотности или изо-электрическом фокусировании. Некоторые виды этих устройств и математические формулы для расчета формы кривой градиента плотности описаны Свенссоном [1259]. Приборы нескольких типов, позволяющие по желанию легко получать градиент плотности нужной формы, выпускаются промышленностью.
