Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 7. Схематическое изображение устройства для зонального электрофореза в свободной среде. I ~ электродные сосуды; 2 — мотор, вращающий электрофоретическую трубку (3)\ 4 — пробка из геля. Положение УФ-поглощающих зон (5) определяли при помощи оптической сканирующей системы (6, 7, 8).
о| о о о
*
в о р
/ \
У Л 'V,
'/ I
I!' to
ГГ
/'/
//' "! )})
II! "
' I 1 'h i\
Рис. 8. Схематическое изображение кюветы для электрофореза в тонком слое жидкости ([509], с изменениями).
Большое преимущество данного метода заключается в том, что он дает возможность провести препаративный электрофорез без всякой поддерживающей среды и таким образом избежать трудностей, связанных с отделением от нее исследуемого материала. Этим способом можно выделять вещества, которые особенно чувствительны к взаимодействию с поддерживающей средой. Хэнниг [508] и Изихай (цитируется по Мауреру [839]) описали фракционирование сывороточных белков. При разделении изоферментов пероксидазы Эванс [344] показал, что включение в состав буфера 10%-ной сахарозы улучшает разделение фракций благодаря уменьшению скорости диффузии.
Несмотря на очевидные преимущества, этот метод не нашел еще широкого применения, быть может, из-за высокой стоимости и сложности используемого аппарата. По-видимому, он может приобрести действительно важное значение в таких областях, как разделение интактных клеток и субклеточных частиц, в которых другие методы электрофореза практически не применимы.
1.4. Зональный электрофорез в градиенте плотности
Одним из путей стабилизации зон при электрофорезе и изо-электрическом фокусировании, как и при ультрацентрифугировании, служит применение колонок с градиентом плотности. Этот прием может быть использован как для аналитических, так и для препаративных целей. Среда в данном случае не является ограничивающим фактором в отношении размеров разделяемых молекул, а их последующее выделение относительно проще, чем при работе с другими поддерживающими средами.
Филпот [1005] первым попытался попользовать градиенты плотности для стабилизации зон в процессе электрофореза; он посвятил проблемам, связанным с этим методом, обширное теоретическое исследование. К методу, основанному на применении градиентов плотности, вновь вернулись в 50-х годах Брэкке [161, 162], Колин [699—702], Свенссон и Вэлмет [1263, 1264], а также другие авторы. Их усилия привели к разработке специального прибора и усовершенствованиям в методике.
Первые результаты, полученные в этой области, детально рассмотрены в ряде обзоров [703, 1189, 1259].
ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К ГРАДИЕНТАМ ПЛОТНОСТИ
При использовании градиента плотности для стабилизации зон против конвекции «общие условия, необходимые для создания стабильности, можно сформулировать следующим образом: плотность раствора в колонке на всем ее протяжении и в любой момент должна возрастать сверху вниз или градиент по всей длине колонки и в любой момент должен быть положительным» [1259]. Условия получения градиентов плотности, удовлетворяющих требованиям проведения зонального электрофореза, были подробно исследованы Свенссоном и др. [1265].
Поскольку плотности растворов, как правило, изменяются почти линейно с изменением концентрации растворенного вещества, получение градиента плотности практически превращается в задачу создания градиента концентрации с использованием какого-либо подходящего растворенного вещества. Это
вещество должно обладать весьма высокой растворимостью, чтобы обеспечить значительные различия между плотностями самого низкого и самого высокого слоев в колонке. Разумеется, растворенное вещество не должно взаимодействовать с разделяемым материалом и не должно иметь никакого заряда при тех условиях, при которых проводится электрофорез.
Наиболее часто для формирования градиентов плотности используется сахароза, по своим свойствам соответствующая указанным выше требованиям. Кроме того, она дешева и ее раствор обладает определенной вязкостью, способствующей стабилизации зон; в то же время эта вязкость не настолько высока, чтобы препятствовать движению заряженных молекул и частиц. Для этой же цели можно применять и другие вещества, наггример глицерин, этиленгликоль, тяжелую воду и в ограниченном диапазоне концентраций этанол.
