Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
С — концентрация сшивающего реактива в процентах от общего количества мономеров (Т)
D — константа диффузии
Т — общая концентрация мономеров (акриламида и сшивающего реагента)
U — подвижность
Uо — подвижность в свободном растворе |л — иоиная сила а — стандартное отклонение
I. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
1.1. Принципы электрофореза. Краткий обзор
Биологические макромолекулы — белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды — находятся в растворе в виде частиц, которые по своим размерам соответствуют коллоидным частицам. Они несут определенный электрический заряд благодаря наличию групп, способных к электролитической диссоциации. Общий заряд данной частицы определяется прежде всего концентрацией Н+-ионо'В в среде и может изменяться тгри ее взаимодействии с ионами малой молекулярной массы или другими макромолекулами. Под действием электрического поля заряженные частицы перемещаются к катоду или аноду в зависимости от знака их суммарного заряда. Такое явление носит название электрофореза. Скорость движения частицы (см/с) при напряженности электрического поля 1 В/см называется электрофоретической подвижностью. Она имеет размерность см2-с~1*В“1, а ее знак совпадает со знаком суммарного заряда. Различия в подвижности частиц служат основой для разделения смесей веществ в аналитических или препаративных целях. Определение подвижности используется также для характеристики вещества.
Чтобы понять поведение макромолекул в электрическом поле, необходимо теоретически определить зависимость между подвижностью молекулы и такими ее параметрами, как электрический заряд и коэффициент трения, а также выяснить влияние на указанные параметры состава раствора. Мы лишь кратко коснемся этих вопросов. Для детального изучения проблемы читатель может обратиться к другим работам (например, [953, 954, 1172]).
Рассмотрим изолированную частицу, взвешенную в идеальном диэлектрике. Если приложить равномерное электрическое поле (?), то на частицу будет действовать сила, ранная QE (где Q — общий заряд частицы). Когда частица выйдет из состояния покоя и начнет двигаться, возникнет противоположно направленная сила трения f(dxfdt), где f — коэффициент трения и dx/dt — скорость движения частицы. Результирующая этих двух сил в соответствии со вторым законом Ньютона рав-
на m(d2x/d/2), откуда получаем уравнение
0>
Решение этого уравнения может быть представлено в следующем виде:
Поскольку величина //m^> 1 {она составляет 1012—1014 для частиц, имеющих размеры молекул), значение ехр(—flm)t снижается до 1/е при /=10“14—10_12 с, и поэтому для промежутков времени длиннее чем ~ 10_п с уравнение (2) упрощается:
Это означает, что при наложении электрического поля скорость движения частицы быстро увеличивается до тех пор, пока электрическую силу не уравновесит сила трения. Затем частица движется с постоянной скоростью в соответствии с уравнени-
Для сферических частиц коэффициент трения равен блт^а, где а — радиус частицы и т| — коэффициент вязкости растворителя (закон Стокса). При этом радиус частицы целесообразно исключить путем замены отношения Q/a выражением ?>гр0, где t|?o — потенциал на поверхности сферы, равный Q/Da, a D — диэлектрическая постоянная частицы. Тогда подвижность (U) сферы можно выразить уравнением
Очевидно, что это соотношение, выведенное для заряженных частиц, движущихся в идеальном диэлектрике, должно быть видоизменено в случае использования его для электрофореза макромолекул, поскольку такие эксперименты проводятся не в диэлектриках, а в растворах электролитов. При этом следует учитывать, что вокруг заряженной коллоидной частицы существует ионная атмосфера. В связи с наличием электростатических сил между заряженными группами частицы и ионами растворителя частица окружена диффузным облаком ионов с зарядом, противоположным ее собственному. На значительных расстояниях от частицы суммарный заряд в любом элементе объема, достаточно большом по сравнению с атомными размерами, равен нулю. Присутствие этой ионной атмосферы вокруг частицы приводит к тому, что ее электрофоретическая подвиж-
, dje
d t ~~
(2)
ем (3).
ность оказывается меньше, чем предсказанная уравнением (4). Это обусловлено тремя причинами. Во-первых, потенциал на поверхности частицы снижается из-за уменьшения эффективного электростатического заряда. Во-вторых, электрическое поле действует также и на ионы, окружающие макромолекулярную частицу. Поскольку знак заряда ионного облака не совпадает со знаком заряда частицы, облако будет смещаться в направлении, противоположном миграции частицы, замедляя тем самым ее движение (электрофоретическое трение). В-третьих, наблюдается замедляющий аффект другого рода, связанный с тем, что в электрическом поле одни ионы при перемещении приближаются к частице, а другие удаляются от нее. Вследствие этого в ионной атмосфере происходит неттрерывное замещение ионов, что вызывает нарушение ее сферически симметричной формы, так как для вновь входящих ионов требуется определенное время, чтобы найти свое место в поле макромолекулы и прийти в равновесие с ее окружением. В результате двойной электрический слой позади частиц растягивается. Действие тормозящей силы такого типа носит название релаксационного эффекта.
