Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ek“_ кР Uk L'Vl
U k-UPl
чае восходящая и нисходящая границы должны быть зеркальными отражениями друг друга. Избежать аномалии подвижности можно в том случае, если подвижность изучаемого вещества предельно близка к подвижности буферного иона того же знака. Этот вывод следует из рассмотрения регулирующей' функции Кольрауша [191, 779]. Хотя подвижность иона макромолекулы всегда -ниже, чем иона с низкой молекулярной массой, это различие можно уменьшить, если использовать относительно крупные буферные ионы, например ио>ны диэтилбар-битурата.
Электрофорез по методу подвижной границы нашел широкое применение преимущественно при исследовании белков. Многочисленные данные, имеющие основополагающее значение, были получены при определении свойств отдельных белков, анализе белковых омесей, оценке гетерогенности препаратов различных белков, изучении взаимодействий между белками и низкомолекулярными веществами, а также взаимодействий белков между собой. Однако в настоящее время ввиду доступности более удобных методик электрофорез по методу подвижной границы стал применяться значительно реже.
1.3. Зональный электрофорез без поддерживающей среды
1.3.1. Зональный электрофорез в свободной среде со стабилизацией зон вращением
Необходимым условием для электрофоретического разделения компонентов на отдельные зоны является предотвращение конвекции. Иертен [565, 567] для стабилизации разделенных зон в растворе применил вращение электрофоретической трубки. Его метод получил название зонального электрофореза в свободной среде. В процессе электрофореза горизонтальная трубка с внутренним диаметром 3 мм вращается вокруг своей продольной оси со скоростью 40 об/мин. Такое вращение предотвращает конвекционные возмущения, что можно объяснить следующим образом. Рассмотрим некоторую часть образца, помещенную во вращающуюся трубку в положении L как показано на рис. 6. Если эта часть, представляющая собой жидкость, имеет более высокую плотность, чем окружающая среда, то она будет перемещаться вниз, а не по направлению к стенке. При вращении трубки образец станет синхронно колебаться относительно ее поперечного сечения, и в результате будет достигнута стабилизация.
Теоретические выводы, полученные для электрофореза с подвижной границей, применимы также и для зонального электрофореза в свободной среде. Локализацию зон в электрофоретической трубке выявляют путем ее сканирования в ультрафиолетовом свете (рис. 7). Так как количество вносимого в трубку материала не превышает 0,4 мг, описанный вариант электрофореза является микрометодом, однако в пределах этого количества его можно использовать и для препаративных целей. Данный метод целесообразно применять в тех случаях, когда необходимо провести электрофоретический анализ в отсутствие носителей, а количество исследуемого материала недостаточно для метода подвижной границы, для которого обычно требуется около 10 мл по крайней мере 0,5%-ного раствора образца, т. е. 50 мг вещества.
1.3.2. Непрерывный электрофорез в тонком слое жидкости (проточный электрофорез в свободной среде)
По этому препаративному методу электрофорез проводится в тонком слое буферного раствора при его непрерывном ламинарном течении. Силовые линии электрического поля направлены
перпендикулярно току жидкости. Подлежащая разделению смесь непрерывно вводится в поток в соответствующей точ-ке (>рис. 8).
Прибор и методика для этого варианта электрофореза были разработаны Хэннигом [508], описавшим затем усовершенствованную форму
прибора [509]. Позднее Хэн-ниг и Хайдрих обобщили все результаты, полученные этим методом [510].
Электрофоретическая камера создается с помощью двух параллельных стеклянных пластинок, расположенных на расстоянии 0,5 или 1,0 мм друг от друга. Поток раствора электролита должен быть ламинарным и совершенно равномерным. Это достигается путем подачи буфера многоканальным перистальтическим насосом. Разделившиеся фракции собирают в нижней части камеры, используя для этого систему связанных между собой сосудов малого объема (ранняя модель Хэннига [508]) или многоканальный перистальтический на'сос (усовершенствованная модель Хэннига [509]). С обеих сторон проточной камеры помещаются мембраны, через которые осуществляется электрический контакт текущего слоя жидкости с электродными сосудами. Лучше всего для этой цели подходят ионообменные мембраны. Их электрическое сопротивление относительно мало, и поэтому между электрофоретической камерой и-электродными сосудами не возникает большого падения напряжения. На катодной стороне применяется анионообменная: мембрана, а на анодной — катионообменная. Подлежащая разделению смесь непрерывно подается в электрофоретическую камеру при помощи насоса. Прибор снабжен высокоэффективной охлаждающей системой. Одна из стеклянных пластин, служащая стенкой камеры, тонкой пленкой силиконового масла соединена с медной плитой, на которой установлены батареи’ Пельтье.
Рис. в. Стабилизация разделенных зон в результату устранения конвекционных возмущений путем вращения электрофоретической трубки. Показан поперечный разрез горизонтально расположенной вращающейся электрофоретической трубки. Точкой обозначен жидкий элемент пробы, имеющий более высокую плотность, чем плотность окружающей среды. В положении 1 жидкий элемент движется от стенки трубки, а в положении II— в обратном направлении. Таким образом устраняются конвекционные возмущения, заключающиеся в тенденции жидкого элемента двигаться все время в одном направлении по отношению к определенной точке в трубке.
