Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
При проведении электрофореза с подвижной границей встречаются аномалии двух типов. Во-первых, концентрации белков, вычисленные исходя из площадей под соответствующими пиками на электрофореграмме, не являются истинными концентра-
Рис. 1. Кювета (5) Тизелиуса с электродными сосудами (1, 2) в поперечном
разрезе.
циями макромолекулярных компонентов (концентрационная аномалия); во-вторых, скорости движения восходящей и нисходящей границ отличаются друг от друга (аномалия подвижности). Иногда этими аномалиями можно пренебречь, но в тех случаях, когда требуется высокая точность, их необходимо учитывать.
Чтобы объяснить эти аномалии и найти пути их устранения, необходимо привлечь некоторые теоретические соображения. В электрохимии так называемое «число переноса» определяется как число эквивалентов данного иона (j), перенесенных через некоторое сечение раствора при прохождении через него количества электричества, равного числу Фарадея F:
, cj?/j__F—
4 к юоо * к ч
где /j — число переноса для иона j, Vj — подвижность этого иона и к — проводимость раствора. Рассмотрим границу меж-
2—2295
Рис. 2. Начало формирования границ в кювете Тизелиуса. /, II и III— секции электрофоретической ячейки, сдвигающиеся относительно друг друга в горизонтальной плоскости в процессе заполнения ячейки буфером и раствором
белка.
белок
Sytpep
;л
V
В
Рис. 3. Электрофорез смеси двух белков (идеальный случай). Л. До электрофореза. В. Спустя некоторое время после начала электрофореза; левое колено (восходящая миграция): а — смесь обоих белков, с—более быстрый компонент, d — буфер; правое колено (нисходящая миграция): а — смесь обоих белков, р — более медленный компонент, у — буфер. 5. Распределение белков в правом колене после электрофореза (без учета диффузии): р\ и р2 — концентрации белковых компонентов. Г, То же, что и В, но с учетом диффузии.
Д. Производная кривой, изображенной на Г.
Рис. 4. Перемещение границы, показанной на рис. 3, Б, после пропускания 1 фарадея электричества. — перемещенный объем.
Рис. 5. Разделение сыворотки крови больного миеломатозом путем электрофореза с подвижной границей (шлирен-метод). А. Восходящее колено Б. Нисходящее колено. [Фото любезно предоставлено д-ром P. Do-bo (Будапешт).]
ду растворами а и р на рис. 4. При прохождении IF электричества граница а/p перемещается из положения / в положение //. Объем между сечениями / и II равен Va$ . Концентрация иона j (макромолекулярного или буферного) в растворе а составляет саj, а в растворе р— с&j. До прохождения электрического
тока число эквивалентов иона j в объеме Va$ равно саУа$,
а после прохождения тока — (cj выражается в эквивален-
тах на 1 л, а V—в литрах на IF). В соответствии с определением «числа переносов» через сечение раствора в положении I пройдет j эквивалентов иона j, а в положении II—fi j. С другой стороны, число эквивалентов иона j в объеме Va$ составляет что соответствует taj—таким образом, мы получаем следующее уравнение:
tp—tf = cfV^—cfV**. (8)
Используя уравнение (7) и принимая, что C7aj = [/pj = I/j, уравнение (8) можно преобразовать:
Vee) cj“ =(-^—v“3) cPi- О)
Это выражение принято называть «уравнением подвижной границы». На нем основаны приведенные ниже рассуждения. Рассмотрим границу между растворами аир (рис. 3). Возь-
мем ион макромолекулы pi и примем, что cj = cPl и Cj = CpA=0. Тогда
Для любого другого иона, скажем иона к, уравнение (9) имеет вид
Легко понять, что если каФк&, то и са]цфс\. Следовательно, на границе макромолекулярного компонента все виды ионов имеют разные концентрации 'ниже и выше границы раздела, причем эту границу образуют не только макромолекулы. Так как на практике измеряется общее изменение показателя преломления, наблюдаемая величина будет включать градиенты концентрации всех ионов в дополнение к градиенту, соответствующему макромолекуле рь Величина ошибки, возникшей от этого наложения градиентов, составляет 3—10%.
Для анализа аномалии подвижности рассмотрим границу между растворами а и р в нисходящем колене, аналогичную границе между растворами с и d в восходящем колене. Применим и в этом случае уравнение (9); так как саР1 = 0 и cdPl= 0, то
Из этих уравнений получаем
откуда следует, что
усф Ki
—t = -z- и
Vcd ка
Va$=?Vcd, т. e. скорости перемещения восходящей и нисходя-
щей границ различны. Отношение этих двух скоростей приближается к единице при снижении концентрации белка. Концентрационная аномалия также уменьшается при снижении концентрации «она макромолекулы. Однако это снижение не может быть чрезмерным, так как при концентрации ниже 0,5% сильно возрастает нестабильность границы. В идеальном слу-
